水稻PR基因啟動(dòng)子分析及其在抗白葉枯病中的作用.pdf

1、PR基因(Pathogenesis-related gene，PR基因)是一類受病原菌或外源激素特異誘導(dǎo)的基因，研究證明它還和系統(tǒng)性獲得抗性(systematic acquired resistance，SAR)有著密切的關(guān)系，常用做植物SAR建立的特征分子標(biāo)記。在基因表達(dá)的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄的起始是個(gè)關(guān)鍵。特定的啟動(dòng)子起始過程常常決定了某個(gè)基因是否應(yīng)當(dāng)表達(dá)或表達(dá)量的多少。為了分析水稻Marker基因OsPR1b，OsPR5，OsPR10a這

2、三個(gè)PR基因的表達(dá)特性，以進(jìn)一步了解它們的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制。我們構(gòu)建了相應(yīng)的GUS融合表達(dá)載體，進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析和酶活測定。另外，利用Real-timePCR對其在植物激素、三種非生物因子和水稻黃單胞菌P10(PXO124)致病菌處理下的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)研究的主要內(nèi)容如下:
　　1.根據(jù)NCBI中的水稻基因組序列從水稻品種日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)中擴(kuò)增

3、得到了三個(gè)PR基因的部分啟動(dòng)子序列，分別命名為OsPR1bp，OsPR5p，OsPR10ap，將它們放到啟動(dòng)子分析網(wǎng)站上進(jìn)行搜索和掃描，預(yù)測得到了多個(gè)脅迫響應(yīng)元件。構(gòu)建相應(yīng)的OsPR1bp∷GUS，OsPR5p∷GUS,OsPR10ap∷GUS融合表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株。
　　2.Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)在健康植株中，OsPR1b在水稻葉片中的表達(dá)量較高，而在莖、根、愈傷和花器中的表達(dá)量非常低

4、;OsPR5的情況和OsPR1b類似，即葉片中的表達(dá)量相對較高;OsPR10a在各個(gè)組織中均有較強(qiáng)表達(dá)。
　　3.研究轉(zhuǎn)基因水稻的組織特異性時(shí)發(fā)現(xiàn):在OsPR1bp和OsPR5p轉(zhuǎn)基因植株的幼苗期，我們僅能在葉片中觀察到明顯的GUS活性，而在同時(shí)期的OsPR10ap轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉中均能檢測到不同程度的GUS活性，其中根部的GUS表達(dá)特異性的分布在主根和側(cè)根根尖，頂端分生區(qū)處尤為明顯。轉(zhuǎn)基因植株幼葉中GUS染色大多集中在葉尖

5、和葉緣上，到了水稻秧苗期和開花期，葉片上的GUS染色基本呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀的隨機(jī)分布，其中，苗期時(shí)的OsPR5p在葉鞘附近表現(xiàn)出了類似傷害誘導(dǎo)的GUS活性，開花期的劍葉切口處也能觀察到較為明顯的GUS表達(dá)，另外，在OsPR10ap轉(zhuǎn)基因植株的葉片茸毛中也觀察到了GUS染色。OsPR1bp在小花中并無表達(dá)，OsPR5p和OsPR10ap在穎殼和花藥上均有表達(dá)。三個(gè)啟動(dòng)子在萌發(fā)的種胚內(nèi)均能啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因抗性愈傷中均存在GUS活性，其

6、中，OsPR1bp較弱，OsPR5p和OsPR10ap較強(qiáng)。
　　4.對野生型水培苗進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):植物激素SA、MeJA、KT、ABA及NaCl、PEG可提高OsPR1b在葉片中的表達(dá)水平，MeJA、KT和NaCl的處理可提高其在根部的表達(dá)水平;MeJA、GA、KT、ABA及NaCl、H2O2可提高OsPR5在葉片中的表達(dá)水平，MeJA、KT、ET和NaCl、PEG、H2O2的處理可增加其在根部的表達(dá)水平;MeJA

7、、KT、ABA及NaCl、PEG可提高OsPR10a在葉片中的表達(dá)水平，MeJA、IAA、KT、ET和NaCl、PEG的處理可增強(qiáng)OsPR10a在根部的表達(dá)水平。這些激素在誘導(dǎo)基因在葉片和根部的表達(dá)程度上存在著明顯的差異。單獨(dú)接種致病菌株P(guān)10后24 hr對三個(gè)基因的表達(dá)影響不大，而當(dāng)與MeJA共同處理后則可顯著增強(qiáng)OsPR1b，OsPR5在葉片中的表達(dá)。
　　5.對轉(zhuǎn)基因水培苗進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)研究發(fā)現(xiàn):JA可增強(qiáng)OsPR1bp在葉片

8、中的GUS表達(dá)活性;JA和KT可提高OsPR10ap在葉片中的GUS表達(dá)活性。Xoo的接菌處理可明顯改變OsPR10ap的表達(dá)模式。
　　此外，為了進(jìn)一步明確PR基因在激素相關(guān)突變體中的表達(dá)調(diào)控變化以及激素在防御反應(yīng)中所起的作用。我們還構(gòu)建了部分甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因(SAMdependent carboxyl methyltransferase gene，SAMT)的超表達(dá)載體，RNAi干涉載體，亞細(xì)胞定位載體以及啟動(dòng)子分析表達(dá)載體