玉米蟲害誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的研究.pdf

1、植物在感知到蟲害信號(hào)后會(huì)發(fā)生復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，開啟防御基因的表達(dá)。這一過程涉及介導(dǎo)防御反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和防御基因啟動(dòng)子上受到蟲害誘導(dǎo)的順式元件，并且受到茉莉酸信號(hào)途徑的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)利用RNA-seq技術(shù)系統(tǒng)研究了玉米在玉米螟咬食和茉莉酸處理后的轉(zhuǎn)錄組變化，并確定了受蟲害和茉莉酸強(qiáng)烈誘導(dǎo)的候選基因?？寺『蜻x基因啟動(dòng)子，并檢測(cè)其在擬南芥中是否也具有受茉莉酸或蟲害誘導(dǎo)的特性。通過對(duì)這些候選基因的研究，完善對(duì)于植物防御反應(yīng)中表達(dá)調(diào)控機(jī)制的理解，并期

2、待獲得蟲害誘導(dǎo)高表達(dá)的啟動(dòng)子，為生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的RNAseq數(shù)據(jù)，從中選取了受蟲害和茉莉酸強(qiáng)烈誘導(dǎo)的兩個(gè)基因，Zm281(GRMZM2G117281)、ZmP al（GRMZM2G154523）分別克隆候選基因ATG前1815bp、1655bp啟動(dòng)子序列，連接pBAR-GUS表達(dá)載體，該載體以Basta作為篩選劑，以GUS為篩選標(biāo)記基因。利用花序浸染法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，共轉(zhuǎn)化擬南芥植株15

3、0余株。Basta初步篩選后移栽，CTAB法提取擬南芥DNA，PCR法檢測(cè)陽性植株。獲得T0代陽性植株收獲種子。
　　隨后為確定啟動(dòng)子的組織特異性，利用MeJA處理T1代植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，觀察染色情況。發(fā)現(xiàn)候選基因啟動(dòng)子在不做處理時(shí)GUS染色未顯現(xiàn)顏色，受到MeJA處理后顯藍(lán)色，并在根莖葉花等組織均顯藍(lán)色，可初步判定該啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
　　采用熒光分析法測(cè)定GUS活性，以單位時(shí)間內(nèi)單位蛋白產(chǎn)生4-methlu

4、m bellifer one(MU)的量比較各啟動(dòng)子對(duì)GUS基因表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)陽性植株在受到MeJA誘導(dǎo)后，GUS表達(dá)量升高。對(duì)幼苗期及成熟期分析發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)量基本不變
　　對(duì)上述兩個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，對(duì)生長三周的玉米噴灑200μmol/L的MeJA溶液，處理后的材料分時(shí)間段(0h、1h、2h、4h、6h、16h)取葉片提取RNA。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因在受到MeJA誘導(dǎo)后1h-8h表達(dá)量成明