二色補(bǔ)血草幾丁質(zhì)酶基因chi31和chi32原核表達(dá)及重組酶分析.pdf

1、幾丁質(zhì)酶(chitinase Ec.3.2.14)是一種能降解幾丁質(zhì)及其衍生物的糖基水解酶,它能催化真菌細(xì)胞壁的重要成分——幾丁質(zhì)的水解,從而抑制真菌的生長增殖,提高植物的抗真菌能力,它廣泛存在于各種微生物、植物及動(dòng)物細(xì)胞和組織中,參與多種生理過程。幾丁質(zhì)酶在生物防治和幾丁質(zhì)資源的利用等方面具有巨大的應(yīng)用潛力,因而受到了廣泛的重視。
　　 二色補(bǔ)血草兩個(gè)幾丁質(zhì)酶基因chi31和chi32已被克隆并提交到GenBank(cDNA的

2、GenBank接受號(hào)分別為DQ431248和DQ431249)。本研究中利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)研究了立枯絲核菌脅迫條件下,兩基因在二色補(bǔ)血草中的表達(dá)模式。結(jié)果表明,chi31,和chi32基因能夠應(yīng)答真菌脅迫脅迫,兩個(gè)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因?qū)φ婢『Φ那秩刖蟹烙磻?yīng)。并且在同一組織中,兩基因在表達(dá)上存在時(shí)間上的先后;在不同組織中,同一基因的表達(dá)量也存在差距。這說明,這兩個(gè)基因可能在二色補(bǔ)血草中起到不同的作用,或分別隸屬于不同的生物學(xué)途

3、徑。
　　 利用表達(dá)型載體pET-52b(+)研究兩個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的功能,分別構(gòu)建原核胞內(nèi)表達(dá)載體pET-chi3lin和pET-chi32in。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,獲得轉(zhuǎn)化子BL21-chi3lin和BL21-chi32in。IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),通過對(duì)重組蛋白的SDS-PAGE檢測,得到了重組蛋白的陽性菌株。利用改良的Schales法對(duì)轉(zhuǎn)化子的酶活力進(jìn)行測定,證實(shí)了重組酶CHI3lin和CHI32in的酶活性。并且對(duì)重組酶酶學(xué)

4、特性進(jìn)行了分析:重組酶CHI3lin最適酶促反應(yīng)條件為Mn2+5mmol/L,溫度40℃,pH值5.0。依照該體系以楊樹葉枯病細(xì)胞壁為底物測得的重組酶CHI3lin發(fā)酵液粗酶活能達(dá)到0.772U。重組酶CHI32in最佳反應(yīng)體系Ba2+5mmol/L,溫度45℃,pH值5.0。依照該體系以楊樹爛皮病菌細(xì)胞壁為底物測得的重組酶CHI32in發(fā)酵液粗酶活能達(dá)到0.792U。
　　 進(jìn)一步構(gòu)建了原核胞外表達(dá)載體pET-chi3lex、

5、pET-chi32ex。重組酶CHI3lex最適酶促反應(yīng)條件為Zn2+5mmol/L,溫度40℃,pH值5.0。依照該體系以楊樹葉枯病細(xì)胞壁為底物測得的重組酶CHI3lex發(fā)酵液粗酶活能達(dá)到0.921U。重組酶CHI32ex最適酶促反應(yīng)體系K+5mmol/L,溫度45℃,pH值5.0。依照該體系以楊樹爛皮病細(xì)胞壁為底物測得的重組酶CHI32ex發(fā)酵液粗酶活能達(dá)到0.897U。
　　 在胞外原核表達(dá)中無論是在重組酶對(duì)真菌細(xì)胞壁的酶

6、活還是對(duì)化合物的酶活都普遍高于胞內(nèi)原核表達(dá)的重組酶的酶活。在胞內(nèi)原核表達(dá)中,重組酶CHI3lin對(duì)楊樹葉枯病細(xì)胞壁的酶活為0.499U,而在胞外原核表達(dá)中CHI3lex的酶活則高達(dá)0.921U。重組酶CHI32in對(duì)楊樹爛皮病細(xì)胞壁的酶活為0.702U,而在胞外原核表達(dá)中則高達(dá)0.897U。這個(gè)結(jié)果也間接證明了胞外原核表達(dá)中的重組酶具有降解病原真菌細(xì)胞壁的潛力,為CHI3lex和CHI32ex在生防方向的應(yīng)用提供了依據(jù)。而胞內(nèi)原核表達(dá)中