青稞查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及原核表達(dá)分析.pdf

1、青稞（Qingike，Hordeum vulgareL.var.nudum Hook.F）也稱裸大麥，其籽粒富含黃酮等營(yíng)養(yǎng)功能成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用，已越來(lái)越受大麥研究者的青睞。黃酮類化合物是一類在自然界廣泛分布的多酚類次生代謝物質(zhì)，是色原烷或色原酮的衍生物，在植物自身生理活動(dòng)中起著重要的作用，參與紫外線防護(hù)、花色形成、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、抗病原微生物、誘導(dǎo)植物與微生物相互作用等，與人類的健康有密切的聯(lián)系，具有清除自由基、保護(hù)心腦

2、血管、抗腫瘤、抗氧化和抗炎癥等多種藥用價(jià)值。類黃酮代謝是植物中重要的次生代謝途徑之一，是植物黃酮合成的重要方式。
　　查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI，EC5.5.1.6)是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的黃酮類物質(zhì)合成相關(guān)酶，也是類黃酮代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)將雙環(huán)的查爾酮轉(zhuǎn)化為有生物學(xué)活性的三環(huán)二羥基黃烷酮，對(duì)黃酮類物質(zhì)的合成具有重要作用。本研究以實(shí)驗(yàn)室篩選的高黃酮青稞品種“94-19-1”為材料，通

3、過(guò)同源克隆獲得青稞查爾酮異構(gòu)酶基因HvCHI的編碼序列CDS(Coding sequence)全長(zhǎng)，對(duì)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和進(jìn)化樹(shù)分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體并進(jìn)行了原核表達(dá)初步研究，為深入研究CHI基因在青稞類黃酮代謝中的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，對(duì)青稞高黃酮含量的育種具有指導(dǎo)價(jià)值。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)GenBank中已登錄的大麥CHI基因的CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)同源克隆及測(cè)序成功得到青稞CHI基因的CDS區(qū)全

4、序列，CDS區(qū)全長(zhǎng)696 bp，編碼231個(gè)氨基酸。酶蛋白分子量為23.68 KDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)(PI)為5.22，為酸性蛋白。酶蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為23.96，屬于穩(wěn)定蛋白。其所有氨基酸組成中Ala最多，Cys、Gln和Trp最少。平均親水指數(shù)為0.299，屬于親水性蛋白。存在5個(gè)絲氨酸和1個(gè)酪氨酸磷酸化活性位點(diǎn)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白無(wú)信號(hào)肽。預(yù)測(cè)該酶蛋白為非分泌性蛋白。二硫鍵預(yù)測(cè)軟件分析表明，在Cys113和Cys183一個(gè)區(qū)域

5、可能存在二硫鍵。
　　2.對(duì)包括青稞在內(nèi)的14種植物的CHI基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明:該進(jìn)化樹(shù)分為2個(gè)亞群:單子葉植物(Ⅱ)和雙子葉植物(Ⅰ)。其中Ⅰ類包含了矮牽牛、葡萄、百脈根、金蕎麥、苜宿、菜豆等植物;Ⅱ類包括普通小麥、玉米、大麥和節(jié)節(jié)麥等植物。青稞CHI基因與同為單子葉的大麥、節(jié)節(jié)麥等的同源性最高，與雙子葉植物的橙子、矮牽牛同源性最低。
　　3.將青稞CHI基因的編碼序列與表達(dá)載體pET-32a相連后，pET-3