興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的克隆及表達(dá)特性分析.pdf

1、興安落葉松（Larix gmelinii）是松科落葉松屬的落葉喬木，在我國(guó)東北、內(nèi)蒙古林區(qū)以及華北、西南的高山針葉林樹種中占據(jù)了很大的比例，同時(shí)也是東北地區(qū)重要的針葉用材林樹種。作為一個(gè)寒溫帶及溫帶樹種，興安落葉松的水平分布范圍廣泛，垂直分布達(dá)到森林分布的上限，冬季在零下50℃的低溫條件下仍然可以安全越冬。作為最耐寒的針葉樹種，興安落葉松應(yīng)該存在獨(dú)特的抗寒機(jī)制，蘊(yùn)藏著珍貴的抗凍基因資源。因此，開發(fā)興安落葉松的抗寒基因資源，解明其抗寒分子

2、機(jī)制具有重要的意義。
　　幾丁質(zhì)酶是一種植物抗逆相關(guān)蛋白，在植物防御系統(tǒng)中占有一定比例，特別是在植物抵御病害及低溫的過程中發(fā)揮著重要的作用。幾丁質(zhì)酶在正常情況下表達(dá)量較低，而在低溫、干早、鹽脅迫等不利因素的誘導(dǎo)下表達(dá)量會(huì)增高。
　　本研究通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因（Lgchia）的全長(zhǎng)cDNA序列991 bp，其包含一個(gè)813 bp的開放閱讀框、36 bp的5'非編碼區(qū)和143 bp的3'非編

3、碼區(qū)。該基因編碼270個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為80.1 kDa，理論等電點(diǎn)為5.07。通過在線軟件對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析:二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，Lgchia的二級(jí)結(jié)構(gòu)以Random coil為主，Extend strand和Alpha helix為輔;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，Lgchia基因可能編碼一種分泌蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中;蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，Lgchia的N端含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，顯示Lgchia可能是膜結(jié)合蛋白;功能結(jié)構(gòu)域分析表

4、明，Lgchia屬于糖苷水解酶19家族的幾丁質(zhì)酶;系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，興安落葉松的幾丁質(zhì)酶基因與花旗松的幾丁質(zhì)酶基因的親緣關(guān)系較為相近。
　　利用半定量RT-PCR的方法對(duì)該基因的表達(dá)特性進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果顯示:Lgchia在興安落葉松幼苗的根、莖和針葉中均有表達(dá)，在莖中的表達(dá)量最高，根中的表達(dá)量最低;低溫、鹽(NaCl)和PEG-模擬干旱脅迫處理?xiàng)l件下，Lgchia的表達(dá)量均有明顯提高;在15％ PEG處理下表達(dá)量變化幅度較小，在

5、4℃低溫處理?xiàng)l件下表達(dá)量變化較為明顯。在4℃低溫處理1-24 h的過程中，處理1-6 h時(shí)Lgchia表達(dá)量明顯提高，處理12 h時(shí)表達(dá)量有輕微下降，處理24 h時(shí)表達(dá)量下降較明顯，但處理后的表達(dá)量均高于對(duì)照，顯示該基因在興安落葉松抵御低溫脅迫中發(fā)揮重要作用。
　　該研究成果為進(jìn)一步分析該基因的功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)理及興安落葉松的抗寒分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為利用興安落葉松的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行農(nóng)作物及林木的抗寒性遺傳改良提供了有價(jià)值的