飼料及原料中轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)的研究.pdf

1、飼料行業(yè)是轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品的第一大用戶，為了完善轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度的實施，急需建立科學(xué)有效、簡便快速的飼料轉(zhuǎn)基因成分檢測方法。本研究旨在從核酸水平和蛋白水平對轉(zhuǎn)基因大豆、豆粕和不同類型的配合飼料產(chǎn)品進(jìn)行定性和定量檢測；并通過干熱處理、濕熱處理和擠壓膨化試驗，研究了溫度、濕度和壓力對轉(zhuǎn)基因大豆中內(nèi)、外源基因以及外源蛋白含量的影響，為規(guī)范轉(zhuǎn)基因飼料加工工藝及其安全性評價提供科學(xué)依據(jù)，主要結(jié)果如下：
　　1.對SDS法和CTAB法進(jìn)行改良

2、，并與試劑盒法進(jìn)行比較，確定改良SDS方法能夠高效快速地提取深加工飼料及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因大豆的基因組 DNA，質(zhì)量和純度均高于改良CTAB法和試劑盒法。
　　2.通過普通PCR方法擴增轉(zhuǎn)基因大豆的品系特異性基因，表明飼料及原料中的轉(zhuǎn)基因大豆屬于GTS40-3-2品系；采用LAMP方法對轉(zhuǎn)基因飼料及原料中的CP4- EPSPS基因進(jìn)行快速檢測，靈敏度至少為普通PCR方法的100倍；以轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)源基因 Lectin，CaMV35S啟動

3、子和CP4- EPSPS抗草甘膦基因作為檢測對象，建立了兩套（Lectin1/35S/ CP4、Lectin2/35S/ CP4）轉(zhuǎn)基因飼料產(chǎn)品的三重 PCR檢測體系，靈敏度分別為0.25％和0.5%；選用含有8個目的基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pTLE8替代陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，繪制了內(nèi)源基因Lectin和外源基因CP4– EPSPS的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2>0.99，具有良好的精密度和重復(fù)性，CP4-EPSPS基因的定量低限為1.57拷貝，該體

4、系能夠滿足不同類型轉(zhuǎn)基因飼料產(chǎn)品的定量檢測需求。
　　3.利用原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)CP4- EPSPS基因，經(jīng)SDS- PAGE電泳分析，表明CP4- EPSPS重組蛋白在上清中表達(dá)量較高，經(jīng)過純化、透析、凍干后，獲得CP4-EPSPS蛋白抗原，大小約為50 kDa，并制備了效價為1：729000的CP4-EPSPS多克隆抗體。
　　4.建立了轉(zhuǎn)基因飼料產(chǎn)品的Western Blot和ELISA檢測系統(tǒng)，篩選并優(yōu)化了各項參數(shù)

5、，檢出限分別為0.5%和0.25%，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。13份飼料產(chǎn)品經(jīng)Western Blot檢測，都有雜交信號出現(xiàn)，表明都含有CP4- EPSPS蛋白；間接ELISA結(jié)果表明飼料原料中轉(zhuǎn)基因蛋白的含量較高，加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因蛋白的含量較低。
　　5.以轉(zhuǎn)基因豆粕的Lectin基因和CP4- EPSPS基因的特定區(qū)域為模板，分別設(shè)計4對嵌套式引物，對經(jīng)過干熱、濕熱和擠壓膨化處理的豆粕分別進(jìn)行定性和定量PCR檢測。結(jié)果表明不同