轉(zhuǎn)基因雜交大豆品系特異性PCR檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因雜交大豆是抗草苷膦轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆雜交而成的一種新品系轉(zhuǎn)基因大豆,轉(zhuǎn)入的外源基因明確,包含的外源基因元件為CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子,導(dǎo)入的外源目的基因?yàn)镃TP4-EPSPS基因,該基因?qū)Τ輨┯心褪芄δ?不被除草劑殺死,農(nóng)田試驗(yàn)驗(yàn)證了具有耐除草劑作用。本實(shí)驗(yàn)通過擴(kuò)增CaMV35S的旁側(cè)序列,采用定性PCR和定量PCR建立了轉(zhuǎn)基因大豆的品系特異性檢測(cè)技術(shù),為我國(guó)轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)實(shí)施提供檢測(cè)技術(shù)支撐。
　　 本

2、實(shí)驗(yàn)采用染色體步行和巢式PCR方法擴(kuò)增出轉(zhuǎn)基因大豆CaMV35S插入的邊界序列,并根據(jù)邊界序列設(shè)計(jì)品系特異性(event specific PCR)引物,建立了轉(zhuǎn)基因大豆的品系特異性PCR方法;以CaMV35S/plant邊界序列為靶序列,設(shè)計(jì)引物探針,建立了轉(zhuǎn)基因大豆SYBR Green和Taqman探針定量檢測(cè)系統(tǒng),并采用SYBR Green法檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)。結(jié)果如下:
　　 (1)采用染色體步行法獲得了轉(zhuǎn)基因大豆CaM

3、V35S插入位點(diǎn)的左邊界序列241bp,序列同源性分析,CaMV35S位置為181～241bp,前1～180bp為大豆基因組序列,將獲得的大豆基因組序列同大豆基因組網(wǎng)站(Phytozome)數(shù)據(jù)庫(kù)相比對(duì),對(duì)轉(zhuǎn)入的外源基因在染色體中的位置進(jìn)行定位,結(jié)果表明35S旁側(cè)序列位于2號(hào)染色體上:Gm02-7912905～7912740。
　　 (2)根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)3對(duì)定性PCR引物,經(jīng)過篩選和PCR條件優(yōu)化,確定DD1-F/R為最佳引

4、物對(duì),擴(kuò)增片段為244bp。靈敏度驗(yàn)證證明當(dāng)轉(zhuǎn)基因大豆含量為0.1％時(shí)仍能檢測(cè)出特異性目的片段,結(jié)合特異性和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證明該引物可以滿足該轉(zhuǎn)基因大豆品系的品系特異性檢測(cè)。
　　 (3)根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆CaMV35S左邊界序列,設(shè)計(jì)引物和探針,采用SYBRGreen和Taqman探針法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SYBR Green的檢測(cè)限為0.05％,Taqman探針的檢測(cè)限為0.01％,靈敏度高于定性PCR。