轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品的檢測技術(shù)研究.pdf

1、該論文以轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品作為實驗材料,相應(yīng)的包含了兩個相關(guān)而又不同水平的兩個部分.一部分是轉(zhuǎn)基因大豆(Roundup-Ready soybean)及其加工產(chǎn)品的DNA水平的檢測技術(shù)研究,另一部分是轉(zhuǎn)基因大豆的蛋白水平檢測技術(shù)研究.在DNA水平上的研究,首先優(yōu)化了轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品豆粕、豆腐、豆奶和醬油的DNA抽提方法,得到了OD值在1.7-1.9之間的高質(zhì)量的可用于PCR檢測的DNA .隨后,建立了基于聚合酶鏈式反應(yīng)(poly

2、merase chain reaction,PCR)和能夠在同一反應(yīng)管中同時擴增兩個片斷的復(fù)合PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的檢測方法,對轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因EPSPS(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,來源于A.tumefaciens菌株CP4)和內(nèi)源基因Lectin(用于轉(zhuǎn)基因大豆的鑒別)進行檢測.根據(jù)EPSPS和Lectin特異的基因序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計了兩對引

3、物.使用這兩對引物進行的PCR分析結(jié)果表明對轉(zhuǎn)基因大豆的檢測靈敏度可達0.01ng.復(fù)合PCR檢測結(jié)果表明,該文設(shè)計的這兩對引物可以成功的用于轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品豆粕、豆腐、豆奶和醬油的檢測.最后,利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 2.0軟件設(shè)計了相應(yīng)的引物和探針,建立了實時熒光定量PCR的Taqman技術(shù)反應(yīng)體系,并繪出了用于大豆轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的標準曲線.Taqman技術(shù)的PCR分析結(jié)果表

4、明定量PCR檢測的靈敏度可達0.01ng.應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，建立了17株能穩(wěn)定分泌抗EPSPS重組蛋白的單克隆抗體（McAb）的雜交瘤細胞株.所有的雜交瘤細胞株接種至預(yù)先進行腹腔注射降植烷的Bal b/c小鼠腹腔均能穩(wěn)定的產(chǎn)生瘤性腹水，腹水用45％的硫酸銨溶液進行初步純化.隨后將得到的單克隆抗體初步用于轉(zhuǎn)基因大豆的雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）檢測當(dāng)中.利用抗體技術(shù)進行的免疫分析是用于已知抗原檢測的理想方法，單克隆抗體（通常具