轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速檢測技術(shù)的研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展,轉(zhuǎn)基因作物的種類和數(shù)量也急劇增加。由于越來越多的外源插入元件被轉(zhuǎn)入的作物中,直接檢測某種插入元件或特異性轉(zhuǎn)化事件變得費時、費力并且成本較高。所以國外許多轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測機構(gòu)逐步建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速篩選技術(shù),并與矩陣方法相結(jié)合大大提高了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測效率,這種快速篩選技術(shù)在我國還沒有相關(guān)的報道。由于不同國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理存在差異,所以這種快速篩選檢測技術(shù)的方法以及所選用的篩選元件也不盡相同。本研究依據(jù)我國進出

2、口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源基因、調(diào)控元件、標(biāo)記基因和T-DNA通用序列信息建立了適合國內(nèi)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速檢測的方法。主要研究如下:
　　1、pCaMV35S和tNOS在轉(zhuǎn)基因生物及其制品檢測中的適用性研究:pCaMV35S和tNOS是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品篩選檢測中的首選參數(shù),日常檢測中發(fā)現(xiàn),個別標(biāo)準(zhǔn)中的引物存在非特異性擴增和靈敏度差的問題。本實驗收集了國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中常用的擴增片段分別為195 bp、165 bp、147 bp、123 bp的pCaMV

3、35S和擴增片段分別為180 bp、172 bp、165 bp、118 bp的tNOS各四對引物,應(yīng)用普通PCR和實時熒光(Real-time)PCR方法,對8對引物的特異性、靈敏度及在加工品中的擴增性進行了測試和適用性評價。經(jīng)過測試 pCaMV35S165bp和147 bp、tNOS172 bp和165 bp具有很好的特異性,靈敏度高,在不同的加工品中也表現(xiàn)出很強的檢測能力,篩選檢測效果最佳。pCaMV35S195 bp和tNOS18

4、0 bp擴增實驗中擴增微弱,經(jīng)常出現(xiàn)非特異性擴增。pCaMV35S123 bp和tNOS118 bp較其它引物相比擴增弱且擴增不穩(wěn)定。所以本研究通過普通PCR和實時熒光(Real-time)PCR的結(jié)合對不同國標(biāo)中出現(xiàn)的引物進行適用性評價,為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測監(jiān)管提供可靠技術(shù)依據(jù)。
　　2、基于SYBR Green I同時檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品16種元件的快速檢測技術(shù)的研究:本實驗通過收集轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源基因、調(diào)控元件、標(biāo)記基因和T-DNA

5、通用序列信息,重點考慮退火溫度和擴增片段長度,設(shè)計或收集適合于一次性擴增的PCR引物SPS、PLD、Lectin、HMG I/Y、Zein、pCaMV35s、FMV35S、T-35S、E93'、g7、tNOS、Gus、Cry1Ab、cry2Ab、NptⅡ、PAT、Cry2Ab、g7、E9、barnase、barstar21組,實驗中用實時熒光(Real-time) PCR方法,對21組引物的特異性、靈敏度進行了測試,結(jié)合擴增曲線、溶解曲

6、線、Ct值以及引物正常擴增的Tm值,篩選出特異性好、靈敏度高符合轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速檢測的引物。在特異性擴增實驗中,SPS、PLD、Lectin、HMG I/Y、Zein、pCaMV35s、FMV35S、T-35S、E93'、g7、tNOS、Gus、Cry1Ab、cry2Ab、NptⅡ、PAT都成功得到擴增,溶解曲線均為單峰溶解曲線,空白對照沒有產(chǎn)生相應(yīng)的特異性擴增,而 barnase、barstar引物出現(xiàn)非常微弱的擴增,這些微弱的擴增信號

7、可能是由于實驗樣品中該外源基因成分含量較低的原因。所以21組引物都具有很強的特異性。為了測定每組引物的靈敏度,所選用的植物實驗材料均為1％的轉(zhuǎn)基因陽性材料,在經(jīng)過濃度梯度稀釋,稀釋后的轉(zhuǎn)基因含量均小于0.01％。通過測試,21組引物中除cry2Ab、PAT的靈敏度為0.1％外,其余引物的檢測靈敏度均為0.01％。計算每種引物所能檢測的最低拷貝數(shù),除 cry2Ab最低可檢測42個拷貝,PAT最低可檢測85個拷貝外,其余引物均能檢測到低于1

8、0個拷貝。通過實驗可以看出,每種引物在正常擴增是均有固定的Tm值(誤差在1℃內(nèi)),這就為檢測轉(zhuǎn)基因含量較低的樣品提供了可靠的依據(jù)。
　　3、基于轉(zhuǎn)錄組測序?qū)D(zhuǎn)基因水稻中 Bt基因和其他非預(yù)期基因表達的研究:本文對W1201克螟稻、W1202秀水11、W1207眀恢86、W1208 TT51、W1209明恢63、W1109科豐6進行轉(zhuǎn)錄組測序,比較并分析轉(zhuǎn)基因水稻與其受體材料的基因表達差異,篩選出了預(yù)期表達基因Bt和轉(zhuǎn)基因水稻中的非

9、預(yù)期表達基因。Bt基因在轉(zhuǎn)基因水稻中均得到表達,尤其在W1109科豐6中Bt基因表達量明顯高于W1201克螟稻和W1208 TT51,而在非轉(zhuǎn)基因水稻中沒有出現(xiàn)任何表達,這從表達譜測序水平上支持了Bt基因檢測的結(jié)果。通過對差異表達基因進行GO(Gene Ontology)功能和KEGG Pathway分析,這些差異表達基因按其功能主要歸為生物學(xué)過程(Biological process)、細胞組分(Cellular component)

10、、分子功能(Molecular function)三類;按代謝通路主要歸為新陳代謝(Metabolism),基因信息處理(Genetic Information Processing),細胞過程(Cellular Processes)三種代謝途徑。通過對差異表達基因的GO(Gene Ontology)功能和KEGG Pathway顯著性富集分析,最終確定三種轉(zhuǎn)基因水稻在不同生物學(xué)功能和代謝途徑的表達差異。為進一步推測這些非預(yù)期差異表達基