食品中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因作物在全世界范圍內(nèi)的廣泛種植，其食用安全和環(huán)境安全問題一直受到廣大消費(fèi)者和各國政府及相關(guān)機(jī)構(gòu)人員的重視。很多國家和地區(qū)紛紛制定轉(zhuǎn)基因生物安全管理法規(guī)，實(shí)施標(biāo)簽制度，并積極發(fā)展轉(zhuǎn)基因食品檢測監(jiān)測技術(shù)。轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致陽性對照的需求量也在增加。傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建通常是以轉(zhuǎn)基因材料與其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因材料按一定的質(zhì)量比例配制而成，從而獲得一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)品。然而，由于我國對轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品的嚴(yán)格控制，許多轉(zhuǎn)基因品系的標(biāo)

2、準(zhǔn)樣品很難得到。而包含有內(nèi)源基因和外源基因以質(zhì)粒形態(tài)存在的標(biāo)準(zhǔn)分子，具有穩(wěn)定性好、用量少、易保存、易獲得等優(yōu)點(diǎn)，因此，構(gòu)建陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子作為轉(zhuǎn)基因食品檢測的陽性對照材料已成為近幾年來的新型陽性材料研究的熱點(diǎn)。目前，食品中的轉(zhuǎn)基因成分檢測已從定性提高到定量水平，由于傳統(tǒng)定量PCR技術(shù)在到達(dá)擴(kuò)增平臺期時(shí)才開始定量檢測，而不能消除每個(gè)靶基因擴(kuò)增效率的差異產(chǎn)生的定量誤差，導(dǎo)致傳統(tǒng)定量PCR存在較大缺陷。理想條件下，每個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)效率

3、一致，PCR反應(yīng)后DNA濃度與最初的目標(biāo)DNA量是成正比。然而，擴(kuò)增效率在不同的反應(yīng)之間，或在同一反應(yīng)的不同循環(huán)中在不斷變化，特別是在PCR循環(huán)反應(yīng)的后期，擴(kuò)增產(chǎn)物以未知的反應(yīng)速率呈非指數(shù)形式擴(kuò)增。為使檢測的靈敏度達(dá)到最高，常規(guī)PCR大多采用終點(diǎn)定量法，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到最大（即“平臺期”）。但由于試劑的消耗以及聚合酶的逐漸失活，終產(chǎn)物的濃度和目標(biāo)分子的初始濃度間的相互關(guān)系很難確定。近年來發(fā)展的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是集PCR和探針雜交

4、技術(shù)優(yōu)點(diǎn)為一體，通過探測整個(gè)PCR過程中的熒光信號變化，準(zhǔn)確定量DNA模板量，其檢測靈敏度比常規(guī)PCR技術(shù)高100倍左右，可檢測到每克樣品中含2pg轉(zhuǎn)基因DNA量，且對深加工產(chǎn)品和混合樣品都可進(jìn)行定量檢測。相對于終點(diǎn)定量方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系可以隨反應(yīng)的實(shí)際進(jìn)程實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)反應(yīng)變化。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的量和熒光信號的釋放聯(lián)系在一起，而且成一定比例，隨著每個(gè)循環(huán)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的增加，熒光信號也會成比例

5、增加。記錄每個(gè)循環(huán)中釋放的熒光信號量，就可以監(jiān)控整個(gè)指數(shù)期中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的情況。
　　 本文旨在研制幾種常見的轉(zhuǎn)基因作物的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子并提供一套簡便、準(zhǔn)確、高效的轉(zhuǎn)基因食品定量檢測技術(shù)體系，以解決陽性標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏和深加工制品檢測繁瑣、可信度差等技術(shù)難題。這為我國主要糧食作物轉(zhuǎn)基因食品定量檢測標(biāo)準(zhǔn)化提供技術(shù)平臺，為建立完善的切實(shí)可行的深加工制品檢測體系及GMO標(biāo)簽制度有效實(shí)施提供技術(shù)保證，同時(shí)為轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識、環(huán)境安全與使用安全

6、的檢測及長期跟蹤監(jiān)測、監(jiān)控和安全隱患的預(yù)測、預(yù)警進(jìn)而提供技術(shù)支撐。全文主要圍繞定量PCR檢測方法進(jìn)行研究，參考我國最新國家標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)業(yè)部公告、出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和歐盟標(biāo)準(zhǔn)等收集轉(zhuǎn)基因材料，建立了5個(gè)主要物種13個(gè)品系的定量檢測方法，其中轉(zhuǎn)基因玉米(NK603、Bt11、59122、MON810、GA21、MIR604、MON863、TC1507、Bt176)品系9個(gè)，轉(zhuǎn)基因大豆(GTS40-3-2)，轉(zhuǎn)基因油菜(RT73)，轉(zhuǎn)基因大米

7、(TT51-1)，轉(zhuǎn)基因甜菜(H7-1)品系各一個(gè)，這些物種涵蓋了我國已批準(zhǔn)和即將批準(zhǔn)的主要進(jìn)出口轉(zhuǎn)基因植物。檢測的靶序列包括內(nèi)源基因和品系特異性序列共約20個(gè)常見基因序列。以標(biāo)準(zhǔn)樣品作為初期研究對象，驗(yàn)證、優(yōu)化這些基因的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，在獲得穩(wěn)定、準(zhǔn)確、高效的檢測方法后，將之應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物種子、飼料、食品等初加工和深加工食品的檢測中。同時(shí)本文還構(gòu)建了13個(gè)品系共9個(gè)新型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，并對其在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系中的靈敏

8、度、穩(wěn)定性和精確性等指標(biāo)做了進(jìn)一步分析，建立了13個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品系的定量PCR檢測方法，采用Taqman探針法對這些物種的品系特異性序列進(jìn)行定量分析并有效地應(yīng)用到初加工和深加工等食品的轉(zhuǎn)基因成分的檢測中。
　　 在質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的研制中，本部分采用重疊延伸PCR成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、大米、甜菜5個(gè)常見物種13個(gè)品系的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，該技術(shù)與傳統(tǒng)的酶切連接方式不同，它不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶即可實(shí)現(xiàn)DNA片段的體外快速連

9、接。有研究者指出為了最大限度地避免堿基的錯(cuò)配，重疊延伸PCR反應(yīng)一般采用高保真DNA聚合酶，而本實(shí)驗(yàn)中采用了非保真的Taq聚合酶來完成重疊延伸PCR，這種酶沒有3'→5'外切酶的活性，其擴(kuò)增產(chǎn)物在3'端會自動添加堿基A，從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出非保真酶擴(kuò)增結(jié)果也很穩(wěn)定;同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中采用高保真與非保真酶的對比進(jìn)行重疊延伸PCR實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)，連接片段在1000bp以內(nèi)的這兩種酶擴(kuò)增效率幾乎沒有實(shí)質(zhì)差別。此外，對于重疊延伸PCR所需

10、引物的設(shè)計(jì)，本研究采用了兩種設(shè)計(jì)方式:第一種方式是在內(nèi)源基因反向引物和外源基因正向引物基礎(chǔ)上添加與擴(kuò)增引物無關(guān)的互補(bǔ)堿基序列，以這種方式獲得的重組DNA包含了中間連接的“額外”片段。第二種方式是在內(nèi)源基因反向引物和外源基因正向引物基礎(chǔ)上添加與彼此互補(bǔ)的堿基序列，即添加在內(nèi)源基因反向引物的接頭序列為外源基因正向引物的互補(bǔ)序列，添加在外源基因正向引物的接頭序列為內(nèi)源基因反向引物的互補(bǔ)序列，以這種方式獲得的重組DNA片段為兩者擴(kuò)增片段長度之和

11、而不會出現(xiàn)“額外”片段。實(shí)驗(yàn)過程可發(fā)現(xiàn)第二種方式設(shè)計(jì)的引物重組DNA效果明顯優(yōu)于第一種方式。
　　 我們構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子為重組的質(zhì)粒分子，其包含一段或多段外源插入基因及品系特異性序列，以及該物種已經(jīng)鑒定的內(nèi)源基因的部分特異性片段。根據(jù)轉(zhuǎn)基因生物檢測策略，設(shè)計(jì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建方案。目前品系特異性檢測方法因特異性最佳獲得了越來越廣泛的應(yīng)用。本研究構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子分別包含有內(nèi)源基因及其品系特異性序列，其中pMD-1G、pMD-a5、

12、pMD-FR、pMD-sT和pMD-GH五個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)品系特異性序列和一個(gè)內(nèi)源基因序列，pMD-aNB、pMD-aMB、pMD-aGM和pMD-aMT四個(gè)質(zhì)粒含有兩個(gè)品系特異性序列和一個(gè)內(nèi)源基因序列。由于品系特異性序列是特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，為單拷貝序列，比基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品中其它外源基因的拷貝數(shù)更精確，因此品系特異性檢測方法具有很高的特異性和準(zhǔn)確性，也更加適用于構(gòu)建定量PCR檢測所需的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　

13、在定量PCR檢測方法的研究中，為更好地評價(jià)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系的可行性，本研究對該檢測體系的靈敏度、穩(wěn)定性和精確性等指標(biāo)做了進(jìn)一步分析。選用20000copies/μl，2000copies/μl，200copies/μl，20copies/μl，2copies/μl五個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量PCR的LOD和LOQ測定，得出其值分別為2copies和20copies;同時(shí)以轉(zhuǎn)基因大豆為例，測試質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-1G的穩(wěn)定性

14、能，它們的SD和RSD均屬正常范圍，說明標(biāo)準(zhǔn)分子可穩(wěn)定應(yīng)用于定量PCR的檢測中;理想條件下，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子中的不同基因擴(kuò)增效率保持一致，即外源基因和內(nèi)源基因的擴(kuò)增拷貝數(shù)之比為100％，但在實(shí)際檢測中，其他因素常導(dǎo)致擴(kuò)增效率不一致，本研究以1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)樣品作為檢測對象，計(jì)算得出Cf值的平均值為0.94，其SD和RSD分別是0.11和11.57％，據(jù)此可以推斷pMD-1G質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在定量PCR反應(yīng)體系中的擴(kuò)增幾乎同步。又以已

15、知5％、2％、1％、0.5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品測試標(biāo)準(zhǔn)分子用于定量檢測的精確性，結(jié)果顯示實(shí)際測得的轉(zhuǎn)基因成分含量與真實(shí)值之間的差異隨樣品轉(zhuǎn)基因成分含量增高而增加，5％和2％樣品的檢測偏差(bias％)小于5％，樣品轉(zhuǎn)基因成分含量較低時(shí)檢測容易產(chǎn)生較大偏差。
　　 在全面評估質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子各項(xiàng)指標(biāo)后，采用Taqman探針法構(gòu)建了這13個(gè)品系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組樣品的擴(kuò)增效率（Eff％）在95.007％-118.438％正常范圍內(nèi)，線性相

16、關(guān)系數(shù)(R2)≥0.990，同時(shí)每組樣品的三次平行實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很高，這些證明了基于標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量檢測轉(zhuǎn)基因食品的可行性。此外，根據(jù)2692bp長的pMD-18T載體和13個(gè)品系基因組DNA的長度，我們將標(biāo)準(zhǔn)分子分別稀釋成2000000copies/μl,200000copies/μl,20000copies/μl,2000copies/μl,200copies/μl，20copies/μl六個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，由此建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能準(zhǔn)確定