油茶泛素結(jié)合酶E2基因全長cDNA克隆及其RNAi干擾載體的構(gòu)建.pdf

1、油茶(Camellia oleifera)是一種多年生木本科油料作物，是我國重要的木本食用油料樹種。茶油主要由油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸組成，其含量一般在90％以上，是當前國內(nèi)最受歡迎的高營養(yǎng)價值的食用油之一。由于油茶種子的發(fā)育過程處于南方高溫、干旱天氣，土壤貧瘠等生理環(huán)境，因此油茶在生長發(fā)育過程中，會遭受到一些非生物脅迫，如干旱、重金屬、營養(yǎng)缺乏、高鹽，病蟲害、高溫或低溫等。介導蛋白質(zhì)特異降解的泛素/26S蛋白酶體途徑顯著影響著植物的

2、生長發(fā)育，泛素結(jié)合酶E2作為該途徑中的一個關(guān)鍵酶，對植物的細胞周期調(diào)控、植物衰老、細胞分化、激素信號響應(yīng)、光形態(tài)建成及非生物脅迫響應(yīng)等產(chǎn)生了重要的影響。本研究在已有的油茶種子cDNA文庫及EST文庫的基礎(chǔ)上，對油茶E2基因進行全長cDNA的克隆和生物信息學分析，并構(gòu)建了植物RNAi干擾載體。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、油茶E2基因的全長cDNA克隆及生物信息學分析。從本實驗室油茶cDNA文庫中鑒定出一條E2基因的全長cDNA，

3、該基因長度為804bp，經(jīng)與核酸數(shù)據(jù)庫進行比對分析，確定為E2基因，該基因編碼152個氨基酸。應(yīng)用一系列生物信息學分析方法對其等電點、分子量、跨膜結(jié)構(gòu)、疏水性、二級結(jié)構(gòu)等進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示：E2蛋白質(zhì)的分子量為17．4KDa，等電點為5．40。E2整個蛋白的疏水指數(shù)從—3．633到2．122，其中除在37位、102位以及105位氨基酸表現(xiàn)出疏水性，整條多肽鏈表現(xiàn)出親水性。E2蛋白有兩個不明顯的跨膜區(qū)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)油茶E2蛋白二級

4、結(jié)構(gòu)以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，不規(guī)則卷曲散布于整個蛋白質(zhì)中。油茶E2蛋白第77～92位為泛素結(jié)合酶活性位點，其中活性位點中的半胱氨酸位于第88位。
　　 2、油茶E2基因的RNAi干擾載體構(gòu)建。采用片段替換方法構(gòu)建了中間載體pMD19—Dimer。根據(jù)油茶E2基因的序列特點，設(shè)計引物克隆了RNAi干擾載體片段。將干擾片段依次插入到中間載體pMD19—Dimer上。檢測RNAi中間載體構(gòu)建成功后，用引物XbaⅠ和SacⅠ分別雙酶切pMD1