桂花CHS、DFR基因全長(zhǎng)克隆、表達(dá)分析及表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、桂花(Osmanthus fragrans Lour.)又名木犀，是我國(guó)十大名花之一，在園林應(yīng)用上占有重要地位。根據(jù)其花色差異將桂花分為四個(gè)品種群，但種群間花色變異相對(duì)較小，主要為黃色和橙紅色，缺乏藍(lán)色等新奇花色，這在一定程度上限制了其觀賞價(jià)值。
　　花色素苷是植物體內(nèi)最為重要的水溶性色素，其最重要的功能是賦予植物繽紛的色彩。目前其合成途徑與調(diào)控機(jī)制都得到了充分的了解。CHS、DFR基因作為該途徑當(dāng)中兩個(gè)關(guān)鍵基因已在多種植物中進(jìn)行

2、了克隆研究，但在桂花當(dāng)中，其基因結(jié)構(gòu)以及對(duì)桂花花色的形成所起到的調(diào)控作用尚未有報(bào)道，值得進(jìn)行更為深入的探究。
　　本實(shí)驗(yàn)以桂花橙紅丹桂品種為試材，采用RT-PCR和RACE方法克隆丹桂查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基因以及二氫黃酮醇-4-還原酶（Dihydvroflavonol-4-reductase，DFR）基因cDNA全長(zhǎng)。利用NCBI和DNAMAN分析軟件對(duì)該基因進(jìn)行核苷酸序列以及氨基酸序列的分析

3、，利用DNAMAN軟件直接構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析該基因在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系。以橙紅丹桂與籽銀桂品種不同花期的樣品為試材，采用熒光定量PCR和2-ΔΔCT法定量分析兩個(gè)基因在不同花期的表達(dá)量。研究結(jié)果如下：
　?。?）從橙紅丹桂花瓣中成功獲得了一個(gè)丹桂查耳酮合成酶基因cDNA全長(zhǎng)，該基因全長(zhǎng)為1383 bp，包含48bp的5′非編碼區(qū)、162 bp的3′非編碼區(qū)和一個(gè)長(zhǎng)度為1173bp編碼390個(gè)氨基酸的開放閱讀框。序列分析表明該基

4、因具有Cysl64、His303和Asn3363個(gè)活性位點(diǎn)及2個(gè)決定底物特異性的苯丙氨酸殘基 Phe215、Phe265。該基因也具有查爾酮合成酶家族的兩條特征多肽序列： RFMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。Blast序列分析顯示該基因與同屬木犀科的油橄欖相似性達(dá)92％，與其他雙子葉植物的相似性在72%-76%左右。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該基因聚類具有明顯的種屬特性，桂花與唇形科等植物的CHS親緣關(guān)系較近，相似性

5、達(dá)76%以上，符合植物分類學(xué)分類，為今后探究該基因在花色形成中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)進(jìn)行熒光定量 PCR結(jié)果顯示，OfCHS基因在桂花的花瓣及葉片中均有表達(dá)，且在葉片中的相對(duì)表達(dá)量為初花期花瓣表達(dá)量的38倍，在橙紅丹桂中隨著花期，表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的先增后減的趨勢(shì)，而在銀桂品種中，在初花期表達(dá)量最高，而后逐漸降低。
　?。?）從桂花（Osmanthus fragrans）花瓣中成功克隆了一個(gè)二氫黃酮醇-4-還原酶（Dihydvro

6、flavonol-4-reductase，DFR）基因 OfDFR全長(zhǎng)（基因序列號(hào)：KR604812）。序列分析表明，該基因全長(zhǎng)為1214bp，包含一個(gè)長(zhǎng)度為1131bp編碼376個(gè)氨基酸的開放閱讀框，預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為99.68KD，等電點(diǎn)為4.98。功能域結(jié)構(gòu)分析表明，該基因具有典型的DFR蛋白結(jié)構(gòu)功能域，屬于NADB-Rossmann超基因家族。進(jìn)行同源性分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該基因在物種間的相似性較高；其中，桂

7、花OfDFR基因與同屬木犀科的連翹FiDFR基因親緣關(guān)系最近。熒光定量 PCR分析表明，OfDFR在桂花葉片與花瓣中均有表達(dá)，且花瓣中的表達(dá)水平顯著低于葉片；在不同開花時(shí)期的花瓣中，OfDFR基因的表達(dá)呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)；該結(jié)果為進(jìn)一步探究DFR基因在桂花花色形成中的功能與作用奠定理論基礎(chǔ)。
　?。?）將得到的兩個(gè)基因全長(zhǎng)分別與 PBI121表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體，分別命名為35S”:OfCHS、35S”:OfDFR,并利