布魯氏菌實時熒光定量PCR檢測方法與血清快速診斷試紙的初步研究.pdf

1、布魯氏菌病（Brucellosis，簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鸬囊环N人獸共患傳染病。危害人畜健康并給畜牧業(yè)發(fā)展造成巨大損失。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，我國也是布病的高發(fā)國家，新疆、青海、西藏、內(nèi)蒙古等地區(qū)尤為嚴(yán)重，有效的檢疫是預(yù)防和控制布魯氏菌病的重要手段，傳統(tǒng)檢測方法存在易發(fā)生交叉反應(yīng)、操作繁瑣、敏感性低等缺點，研究敏感、特異、快速、適合臨床應(yīng)用的檢測方法已引起了國內(nèi)外的高度重視，本實驗建立的布魯氏菌實時熒光定量PCR與血清快速診斷試

2、紙檢測方法，將會為基層布病檢疫和防控提供技術(shù)支持。本實驗所做的工作及主要成果如下：
　　 1.布魯氏菌BP26蛋白的表達、純化。將bp26基因克隆到pGM-T載體，進行酶切、PCR及測序鑒定后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-BP26，轉(zhuǎn)化表達菌并誘導(dǎo)表達、純化，Western-blot分析其免疫原性。結(jié)果表明正確構(gòu)建了pGM-T-BP26，成功表達了BP26融合蛋白，SDS-PAGE檢測表明獲得了高表達量、高純度的蛋白，并且布魯氏

3、菌陽性血清能特異性與BP26蛋白相結(jié)合，表明具有免疫原性，為后續(xù)的免疫學(xué)檢測試驗奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.建立基于布魯氏菌BP26蛋白的血清快速檢測膠體金免疫層析試紙條。以膠體金標(biāo)SPA和布魯氏菌BP26蛋白制備免疫層析試紙條，并對其特異性、敏感性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進行檢測。結(jié)果試紙條檢測布魯氏菌陽性血清為兩條線，檢測其他細(xì)菌抗血清只有質(zhì)控線顯色，5-10min可觀察結(jié)果，具有良好的特異性；采用該方法、琥紅平板、試管凝集分別檢測45

4、份布魯氏菌M5免疫的小鼠血清，陽性率分別為95.6％（43/45）、86.7％(39/45)和93.3％(42/45)，試紙條與琥紅平板的符合率為90.6％，與試管凝集的符合率為97.9％，試紙條可檢出1:100倍稀釋的羊陽性血清；1:128倍稀釋的小鼠陽性血清，表明具有較好的敏感性；本試紙條在4℃可保存6個月，表明該檢測方法具有較高的穩(wěn)定性。
　　 3.利用二重實時熒光定量PCR技術(shù)建立鑒別診斷布魯氏菌和結(jié)核桿菌的方法。篩選布

5、魯氏菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和結(jié)核桿菌cfp10基因的最佳引物組合，建立二重實時定量PCR鑒別診斷方法，對該方法進行穩(wěn)定性、特異性和敏感性試驗，并對臨床樣品及模擬樣品進行檢測。經(jīng)篩選布魯氏菌的omp25基因與結(jié)核桿菌cfp10基因引物組合最佳，該二重實時熒光定量PCR方法中布魯氏菌Tm值為88℃-89℃，結(jié)核桿菌Tm值為90℃-92℃，對其他供試的菌株則為陰性；該方法對布魯氏菌的DNA最低檢出量為20