鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立.pdf

1、以純化的鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)為抗原,免疫BALB/c小鼠,經(jīng)細(xì)胞融合、篩選,制備出了特異性單克隆抗體,分析了SVCV特異性單克隆抗體的免疫生物學(xué)特性,并建立了雙抗體夾心ELISA方法用于檢測(cè)SVCV。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.SVCV接種于敏感細(xì)胞系EPC增殖,待出現(xiàn)大量細(xì)胞病變時(shí)反復(fù)凍融數(shù)次并收集細(xì)胞懸液。蔗糖密度梯度離心純化細(xì)胞懸液中SVCV。以純化的SV

2、CV為抗原,免疫BALB/c小鼠,100μg/只。小鼠首次免疫采用抗原與弗氏完全佐劑等量乳化,第二、三、四、五次免疫抗原與弗氏不完全佐劑等量乳化。第六次加強(qiáng)免疫不加佐劑。加強(qiáng)免疫后3天取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)SVCV在蔗糖中的浮密度,選擇60％、45％、30％三個(gè)濃度純化病毒。經(jīng)離心共收集到3個(gè)蛋白條帶,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析顯示病毒主要集中于第2個(gè)蛋白條帶。

3、本試驗(yàn)小鼠共免疫6次,最后1次免疫7d后,小鼠斷尾采血,采用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià),最高達(dá)1:2.7×105。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0融合后培養(yǎng),染色體計(jì)數(shù)分析細(xì)胞融合效果,融合率達(dá)到85％。
　　 2.以純化SVCV,EPC包被酶標(biāo)板,未免疫小鼠血清、免疫小鼠血清分別作陰、陽(yáng)性對(duì)照,PBS作空白對(duì)照。每孔加入待測(cè)培養(yǎng)上清,100μL/孔,37℃孵育1 h后PBST洗滌3次；加入1:4000羊抗鼠酶標(biāo)二抗(IgG-HR

4、P)100μL/孔,37℃孵育1 h后PBST洗滌5次；底物(TMB)顯色10min；50μL2 mol/L H2SO4終止,Spectramax Plus384,微孔板式連續(xù)光譜測(cè)度系統(tǒng)測(cè)定450 nm吸光值。有限稀釋法對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。經(jīng)篩選獲得4株能穩(wěn)定分泌抗SVCV單抗的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1F1、3E1、3F5、4F9。將4株雜交瘤細(xì)胞注射小鼠,制備腹水單克隆抗體。每種雜交瘤細(xì)胞株均收集到約10mL腹水。
　　

5、 3.辛酸-硫酸銨法純化4種腹水單克隆抗體,SDS-PAGE分析純化效果。純化后4種單抗均有2條蛋白帶,一條為IgG重鏈(約50 kDa),另一條為輕鏈(約25 kDa)。純化之前雜蛋白較多,而純化之后雜蛋白明顯減少,說(shuō)明該純化方法可有效去除大部分雜蛋白,可以用于單克隆抗體的純化。經(jīng)測(cè)定,SVCV腹水單克隆抗體ELISA效價(jià)為1:160000-1:640000,較雜交瘤細(xì)胞上清效價(jià)明顯升高。亞型鑒定結(jié)果表明,這些單抗分屬2個(gè)亞型(1F

6、1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgG1),輕鏈均為K鏈。Western blot分析顯示,單抗1F1、3F5、4F9能特異性地識(shí)別SVCV的N蛋白(47 kDa),3E1能特異性地識(shí)別SVCV的G蛋白(69 kDa)。采用相加ELISA法對(duì)抗原表位進(jìn)行初步分析,結(jié)果顯示,1F1、3F5、4F9可能識(shí)別相同的表位,3E1則可能識(shí)別不同的表位。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示4株單抗均能對(duì)染毒病灶產(chǎn)生特異性的熒光染色。這些單抗的成功制備為

7、SVCV免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.以制備的鯉春病毒血癥病毒(SVCV)單克隆抗體4F9和羊抗SVCV血清建立了SVCV雙抗體夾心ELISA法。采用方陣滴定法確定了抗原、抗體的最佳反應(yīng)濃度,并對(duì)ELISA各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示:單抗最佳包被濃度為2.5μg/mL,最佳封閉液為2％BSA,37℃封閉1 h。羊抗血清最佳反應(yīng)濃度為1:1000,HRP標(biāo)記抗羊IgG最佳反應(yīng)濃度為1:4000。同時(shí)本研究選擇TMB