豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白亞細(xì)胞定位信號的研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性接觸性腸道傳染病，主要癥狀為嘔吐、腹瀉和脫水。不同年齡的豬都易感染，哺乳仔豬最為嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。ORF3是目前PEDV基因組發(fā)現(xiàn)的唯一的附屬基因，ORF3編碼ORF3蛋白，ORF3蛋白與病毒毒力有關(guān)，因此對PEDV ORF3蛋白開展亞細(xì)胞定位

2、信號的研究，有助于了解該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運及其毒力作用機制。
　　本實驗的研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　⑴實驗前期，將DR13 ORF3蛋白克隆至真核表達載體pEGFP-C1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-PEDV-ORF3，并將它和空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后激光共聚焦顯微鏡（LCM）觀察分析，在pEGFP-PEDV-ORF3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，而在pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，EGFP

3、分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。這表明附加的ORF3蛋白本身或者附加的ORF3蛋白中存在某個結(jié)構(gòu)使其定位在細(xì)胞質(zhì)上。
　?、茷榱蓑炞CORF3蛋白中是否存在這種結(jié)構(gòu)，我們結(jié)合DR13att ORF3的氨基酸序列和CV777wt ORF3預(yù)測跨膜域（TM1:40-63aa、TM2:75-91aa、TM3:116-139aa、TM4:150-173aa）對ORF3蛋白進行了截短分區(qū)。第一部分是包含四個預(yù)測跨膜域的ORF3（1-173aa），第二

4、部分是非預(yù)測跨膜域ORF3（174-225aa），構(gòu)建重組質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后LCM分析，在pEGFP-PEDV-ORF3（1-173aa）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，而在pEGFP-PEDV-ORF3（174-225aa）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，融合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。說明ORF3（1-173aa）中存在某種結(jié)構(gòu)使融合蛋白不進細(xì)胞核。
　　⑶為找出ORF3（1-173aa）中使融合蛋白不進細(xì)胞核表達的結(jié)

5、構(gòu)，我們將ORF3（1-173aa）截短為兩部分，第一部分是ORF3（1-91aa），該部分主要包含TM1和TM2，第二部分是ORF3（92-173aa），該部分包含TM3和TM4，構(gòu)建重組質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后LCM觀察發(fā)現(xiàn)在pEGFP-PEDV-ORF3（1-91aa）轉(zhuǎn)染
　　的細(xì)胞中，融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，而在pEGFP-PEDV-ORF3（92-173aa）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，融合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，

6、表明ORF3（1-91aa）是使融合蛋白不進細(xì)胞核的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。
　?、葹檫M一步分析ORF3（1-91aa）中是否存在使融合蛋白不進細(xì)胞核的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，ORF3（1-91aa）被分為兩部分，第一部分為ORF3（1-39aa），該部分不包含預(yù)測跨膜域，第二部分為ORF3（40-91aa），該部分包含TM1和TM2，構(gòu)建重組質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后LCM觀察發(fā)現(xiàn)在pEGFP-PEDV-ORF3（1-39aa）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，融

7、合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，而在pEGFP-PEDV-ORF3（40-91aa）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　為驗證ORF3（40-91aa）是否是阻止融合蛋白進入細(xì)胞核的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，我們將整段ORF3序列中的40-91aa敲除，并將剩下的片段克隆至表達載體pEGFP-C1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-PEDV-ORF3（1-39+92-225aa）并轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞。16 h后LCM分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)

8、胞核中。這個結(jié)果表明，ORF3蛋白中除攜帶有第40位-91位肽的片段外，其余剩下的片段都能進入細(xì)胞核，所以我們判斷ORF3（40-91aa）是使融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)域。
　?、?ORF3（40-91aa）中某一部分可能是阻止融合蛋白進入細(xì)胞核的重要結(jié)構(gòu)域，因此對ORF3（40-91aa）進行再次截短。ORF3（40-91aa）被分成三部分，第一部分為 ORF3（40-63aa），主要包含 TM1；第二部分為ORF3（64

9、-74aa），該部分是位于TM1和TM2之間的非預(yù)測跨膜域；第三部分為O RF3（75-91aa），該部分包含 TM2，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-PEDV-ORF3（40-63aa）、pEGFP-PEDV-ORF3（64-74aa）、pEGFP-PEDV-ORF3（75-91aa）后分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后LCM觀察結(jié)果，在這三個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Ve ro細(xì)胞中，融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。表明ORF3（40-91aa）中這三個

10、單獨的氨基酸區(qū)段ORF3（40-63aa）、ORF3（64-74aa）、ORF3（75-91aa）都不能阻止融合蛋白進入細(xì)胞核。
　?、饰覀冏C實了TM1，TM2和它們之間的連接多肽都不能阻止融合蛋白進入細(xì)胞核，那么這三個部分中的任意兩部分會不會同時起作用呢？基于此，我們構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒pEGFP-PEDV-ORF3（40-74aa）、pEGFP-PEDV-ORF3（64-91aa）、pEGFP-PEDV-ORF3（40-63+7