草莓灰葡萄孢拮抗菌株的篩選、鑒定及其抗菌活性物質(zhì)研究.pdf

1、本文以草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea)為靶標(biāo)病原菌,采用稀釋法,從農(nóng)田土壤中分離得到一株對其有較強拮抗作用的菌株Loq18,經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化及分子鑒定確定為一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
　　 Lpq18菌株除菌發(fā)酵液具有抗菌活性,根據(jù)其對草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的毒力方程,得最小抑菌濃度(MIC)為20.48mg/mL。除菌發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀得具抗菌活性的粗

2、蛋白,除蛋白后上清液不具抗菌活性,確定其抗菌活性物質(zhì)主要為胞外分泌蛋白。為初步了解此抗菌粗蛋白的理化性質(zhì),分別研究了溫度、pH變化、UV照射、有機溶劑和蛋白酶對其穩(wěn)定性的影響。實驗結(jié)果顯示,該抗菌粗蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性,121℃高壓滅菌處理20min后仍具有對照活性的95％以上;對酸堿不敏感,pH值4～11范圍內(nèi)活性相對穩(wěn)定;對紫外線穩(wěn)定,在紫外光下照射10h以上時,其活性基本不受影響;經(jīng)乙醚、丙酮等有機溶劑處理后仍具有對照活性的90

3、％以上;對部分蛋白酶較穩(wěn)定。
　　 抗菌粗蛋白經(jīng)Sephadex G-75柱層析、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephadex G-25脫鹽,純化獲得抗菌蛋白LP18。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF-MS)、雙縮脲反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)、氨基酸組成分析、脂基和糖基檢測對純化蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明抗菌蛋白LP18是多亞基蛋白,亞基分子量為4283.7 Da,由Le

4、u、Glu、Asp等14種氨基酸組成,含肽鍵及α-氨基酸,不含脂基和糖基。
　　 以實驗室所保存的多種病原菌為靶標(biāo),檢測抗菌蛋白LP18抗菌活性。結(jié)果表明,抗菌蛋白LP18對水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、玉米彎胞病菌(Curvularia lunata)等多株植物病原真菌均有較強拮抗活性,具有防治多種植物真菌病害的應(yīng)用前景。
　　 經(jīng)抗菌蛋白LP18作用后的灰葡萄孢菌(Botrytis ciner