基于PEDV S重組蛋白間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立與單克隆抗體的制備.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcineepidemicdiarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的，以豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉脫水為主要臨床癥狀特征的高度接觸性傳染病。不同年齡和不同品種的豬均易感，哺乳仔豬死亡率達(dá)95％以上。近年來(lái)，PED的流行區(qū)域有逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)，危害嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，PED的及時(shí)確診和防治研究具有重要的意義。
　　 根據(jù)Gen

2、Bank中已經(jīng)發(fā)表的豬流行性腹瀉病毒毒株的S基因序列并參照PMD19-T載體圖譜，設(shè)計(jì)了1對(duì)分別插入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物，采用PCR技術(shù)從豬流行性腹瀉病毒HB/FN株中擴(kuò)增得到一條1080bp的S基因片段。將其連入pMD19-T載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和GenBank上發(fā)表的S基因的核苷酸序列同源性達(dá)94％以上。
　　 根據(jù)抗原性分析選擇其抗

3、原性較高的S基因片段，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到655bp的基因片段，將此基因片段亞克隆插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SFN，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示S重組蛋白的分子質(zhì)量約為25ku，與預(yù)計(jì)的蛋白分子量一致。利用His標(biāo)簽的特性對(duì)S重組蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析顯示純化效果好，無(wú)雜帶。Wes

4、tern-blot試驗(yàn)證明，純化的S重組蛋白可以與PEDV陽(yáng)性血清產(chǎn)生特異性結(jié)合反應(yīng)，證明該蛋白抗原性好。
　　 利用純化的S重組蛋白作為包被抗原，通過(guò)各步反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定了檢測(cè)PEDV抗體的重組S蛋白間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件:抗原經(jīng)4℃包被過(guò)夜;用封閉液(含5％新生牛血清的PBST)37℃封閉1h;待檢血清（用封閉液做1∶100倍稀釋?zhuān)?00μL于37℃反應(yīng)1h;酶標(biāo)二抗（用封閉液做1∶1000倍稀釋?zhuān)?00μL

5、于37℃反應(yīng)45min;加入底物后避光顯色15min;加入終止液50μL后測(cè)定OD450nm。該方法與TGEV、CSFV、PRV、PRRSV等陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，變異系數(shù)均值都小于10％，表明本方法具有較好的特異性和重復(fù)性。
　　 用純化的PEDV重組HIS標(biāo)簽S蛋白做為免疫原，按常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體(McAb)。經(jīng)細(xì)胞融合獲得1株可穩(wěn)定分泌特異性McAb的