四株不同動(dòng)物來(lái)源弓形蟲感染小鼠和雞免疫病理變化的比較研究.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，在世界上分布廣泛，大約有25％-50％的人受到感染。弓形蟲的宿主非常廣泛，貓科動(dòng)物是其唯一的終末宿主，絕大多數(shù)溫血?jiǎng)游锞勺鳛樵摬≡闹虚g宿主，然而不同宿主對(duì)弓形蟲的易感性及轉(zhuǎn)歸均有不同。小鼠對(duì)其極為敏感，可引起急性的致死性感染因而常常作為弓形蟲急性感染的動(dòng)物模型;而雞由于對(duì)弓形蟲的感染不表現(xiàn)任何臨床癥狀，被認(rèn)

2、為是不敏感的中間宿主。為了探尋這兩種動(dòng)物感染弓形蟲后免疫病理學(xué)變化的差異，同時(shí)針對(duì)同一宿主對(duì)不同動(dòng)物來(lái)源的弓形蟲蟲株感染后的免疫病理變化進(jìn)行比較研究，特進(jìn)行了如下工作:
　　 1.貓?jiān)垂蜗x蟲株的分離及其與雞源、豬源和人源蟲株基因型的鑒定
　　 對(duì)江蘇南京地區(qū)11只家貓進(jìn)行弓形蟲抗體IgG的檢測(cè)，篩選抗體陽(yáng)性貓進(jìn)行蟲株的分離。利用鹽酸-胃蛋白酶消化法處理陽(yáng)性貓的心、腦、舌等組織，制成組織懸液腹腔接種小鼠，通過(guò)連續(xù)傳代，分

3、離到2株弓形蟲蟲株，分別命名為CAT2和CAT3。進(jìn)而利用PCR-RFLP方法，對(duì)分離到的貓?jiān)聪x株以及實(shí)驗(yàn)室保存的雞源(JS)、豬源(CN)和人源(RH)共5株弓形蟲蟲株進(jìn)行了基因型的鑒定，通過(guò)對(duì)7個(gè)等位基因5'-SAG2，3'-SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，cB21-4和L358的擴(kuò)增和酶切，證明此5株弓形蟲蟲株均為基因Ⅰ型。
　　 2.四種不同來(lái)源弓形蟲蟲株對(duì)小鼠和雞致病力的比較
　　 小鼠對(duì)弓形蟲非常敏感

4、，而雞通常不敏感。本研究對(duì)四種不同來(lái)源的5個(gè)蟲株RH，CN，JS，CAT2和CAT3對(duì)雞和小鼠的致病力分別進(jìn)行比較，同時(shí)建立弓形蟲感染雛雞的動(dòng)物模型。210只10日齡雛雞分為21個(gè)組，每組10只，5個(gè)蟲株RH，CN，JS，CAT2和CAT3按照5×108，1×108，1×107，和1×106不同劑量腹腔感染10日齡雛雞，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組，僅注射生理鹽水;感染后每日觀察實(shí)驗(yàn)雞的臨床癥狀，逐只測(cè)量直腸溫度，記錄每組雞的死亡情況;利用PCR方

5、法對(duì)53天未死亡的雞進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)急性死亡和53天未死亡的雞進(jìn)行病理組織切片，觀察病理變化。對(duì)小鼠致病力的對(duì)比試驗(yàn)選用腹腔感染和灌胃感染兩種途徑，分別選用260只ICR小鼠，隨機(jī)分為26個(gè)組，每組10只，按照不同的蟲株選擇1×105，1×104，1×103，1×102和1×101劑量進(jìn)行感染，記錄每只小鼠的存活時(shí)間;根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活時(shí)間對(duì)5個(gè)蟲株的致病力進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RH，CN，CAT2和CAT3四個(gè)蟲株對(duì)小鼠和雞的致病力無(wú)顯著差異

6、，而JS株對(duì)小鼠的致病力較弱，但對(duì)雞的致病力較強(qiáng)，這說(shuō)明蟲株的來(lái)源對(duì)弓形蟲的致病性具有重要的影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)1×107劑量的速殖子腹腔感染10日齡雛雞，既能產(chǎn)生適度的臨床癥狀，又能夠使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物避免死亡，可作為弓形蟲體內(nèi)感染雛雞的動(dòng)物模型。綜合考慮小鼠的感染率、存活時(shí)間以及感染過(guò)程中的偶然因素，發(fā)現(xiàn)1×102腹腔感染和1×104灌胃感染是小鼠模型的最佳感染劑量。
　　 3.四種不同來(lái)源弓形蟲蟲株腹腔感染小鼠免疫病理變化的比較

7、　　 本實(shí)驗(yàn)將JS、CAT、CN和RH弓形蟲蟲株腹腔感染小鼠，對(duì)小鼠感染弓形蟲后的免疫病理變化進(jìn)行比較。200只小鼠(18-22g)隨機(jī)分成5個(gè)組，每組40只，分別命名為JS，CAT, CN，RH和陰性對(duì)照組，四個(gè)蟲株JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×102的劑量腹腔感染小鼠，陰性對(duì)照組僅注射PBS。感染后分別在第0天，3天，6天和8天采血和脾臟用于分離血清和脾臟淋巴細(xì)胞，每組10只。弓形蟲循環(huán)抗原和特異性抗體（IgA，IgG、I

8、gM和IgG的亞型IgG1、IgG2a、IgG2b扣IgG3）利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè);脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞以及MHCⅠ和MHCⅡ類分子的變化利用流式技術(shù)進(jìn)行檢測(cè);細(xì)胞因子IFN-γ，IL-12，IL-4，IL-10和IL-17利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè);血清鐵、血清中NO和iNOS的活性利用比色法進(jìn)行檢測(cè)。感染后第6天能夠檢測(cè)到IgM并持續(xù)至第8天;感染后第8天能檢測(cè)到IgA，而IgG及其亞型均未檢測(cè)到;

9、CD4+、CD8+T和NK細(xì)胞分別在第6天、第3天和第3天顯著上升，均在第8天時(shí)顯著下降，在此時(shí)間點(diǎn)僅CN組CD4+T細(xì)胞顯著高于陰性對(duì)照組，4個(gè)感染組CD8+T細(xì)胞雖下降但仍顯著高于陰性對(duì)照組，RH、CN和CAT組NK細(xì)胞顯著高于陰性對(duì)照組;MHCⅠ分子第6天顯著上升但在第8天時(shí)下降，僅CAT組顯著高于陰性對(duì)照組;MHCⅡ分子從第3天顯著下降并持續(xù)至第8天仍顯著低于陰性對(duì)照組;IFN-γ和IL-12在第6天顯著上升均在第8天時(shí)下降，4

10、個(gè)感染組IFN-γ在第8天仍顯著高于陰性對(duì)照組，但JS組IL-12與陰性對(duì)照組無(wú)差異;IL-10和IL-4在第3天顯著上升均在第6天時(shí)顯著下降，4個(gè)感染組IL-10仍顯著高于陰性對(duì)照組，但I(xiàn)L-4與陰性對(duì)照組無(wú)差異;IL-17在第6天顯著上升并持續(xù)至第8天仍高于陰性對(duì)照組;感染后第3天可檢測(cè)到高濃度的NO、血清鐵以及高活力的iNOS，均在第6天達(dá)到最高峰而后下降，第8天時(shí)，僅CAT組NO顯著高于陰性對(duì)照組，4個(gè)感染組的iNOS與陰性對(duì)照

11、組之間差異不顯著，但血清鐵仍顯著高于陰性對(duì)照組。這些結(jié)果反應(yīng)了小鼠抗弓形蟲腹腔感染而引起的免疫病理學(xué)變化，而不同來(lái)源蟲株之間存在的差異可能與蟲株的生物學(xué)特性有關(guān)，說(shuō)明蟲株的來(lái)源對(duì)弓形蟲免疫病理變化也具有重要的影響。
　　 4.四種不同來(lái)源弓形蟲蟲株灌胃感染小鼠免疫病理變化的比較
　　 本實(shí)驗(yàn)將JS、CAT、CN和RH弓形蟲蟲株灌胃感染小鼠，對(duì)小鼠感染弓形蟲后的免疫病理變化進(jìn)行比較。250只小鼠(18-22g)隨機(jī)分成5個(gè)

12、組，每組50只，分別命名為JS，CAT, CN，RH和陰性對(duì)照組，四個(gè)蟲株JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×104的劑量灌胃感染小鼠，陰性對(duì)照組僅灌服等量PBS。感染后分別在第0天，3天，6天，8天和10天采血和脾臟用于分離血清和脾臟淋巴細(xì)胞，每組10只。弓形蟲循環(huán)抗原和特異性抗體（IgA，IgG、IgM和IgG的亞型IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè);脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞和NK

13、細(xì)胞以及MHCⅠ和MHCⅡ類分子的變化利用流式技術(shù)進(jìn)行檢測(cè);細(xì)胞因子IFN-γ，IL-12，IL-4，IL-10和IL-17利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè);血清鐵、血清中NO和iNOS的活性利用比色法進(jìn)行檢測(cè)。感染后第6天TCA陽(yáng)性并持續(xù)至第10天;第10天時(shí)IgG顯著上升并以IgG2a和IgG2b為主;IgA和IgM第6天時(shí)顯著上升并持續(xù)至第10天;CD4+和CD8+T細(xì)胞第6天時(shí)開(kāi)始顯著上升，第8天達(dá)到高峰，各組CD4+T細(xì)胞在第10天

14、下降，與陰性對(duì)照組無(wú)差異，而CD8+T細(xì)胞雖下降，但CN、CAT和JS仍顯著高于陰性對(duì)照組;弓形蟲感染后第3天，JS和CAT組NK細(xì)胞水平顯著上升，第8天時(shí)，四個(gè)感染組均上升并持續(xù)至第10天;CAT組MHCⅠ水平第3天顯著上升，其余三個(gè)感染組無(wú)顯著變化，第8天，四個(gè)感染組均顯著上升，第10天時(shí)開(kāi)始下降，但除JS組外，其余三個(gè)感染組仍顯著高于陰性對(duì)照組;MHCⅡ分子在第3天顯著下降并持續(xù)至第10天;感染后第6天，JS和CAT感染組組IFN

15、-γ顯著上升，第8天時(shí)，RH、CN和JS三個(gè)組顯著上升，但CAT組下降，第10天時(shí)4個(gè)感染組均下降與陰性對(duì)照組無(wú)差異;RH和CAT組IL-12在感染后第3天顯著上升，第6天時(shí)四個(gè)感染組均顯著上升并持續(xù)至第8天，第10天時(shí)開(kāi)始下降僅CAT組顯著高于陰性對(duì)照組;RH和CAT組IL-4僅在第6天時(shí)顯著上升;CN、JS和CAT組IL-17在第8天時(shí)顯著上升而后開(kāi)始下降，第10天時(shí)僅JS組顯著高于陰性對(duì)照組;NO、血清鐵和iNOS的活力均在第3天

16、開(kāi)始顯著上升并持續(xù)至第8天，第10天時(shí)下降與陰性對(duì)照組之間無(wú)差異。這些結(jié)果反應(yīng)了小鼠弓形蟲灌胃感染所引起的免疫病理變化。與腹腔感染小鼠相比，較晚出現(xiàn)的TCA，較早出現(xiàn)并且較高滴度的IgA以及產(chǎn)生的IgG說(shuō)明腹腔感染和灌胃感染兩種不同的感染途徑影響免疫病理變化的產(chǎn)生。
　　 5.四種不同來(lái)源弓形蟲蟲株腹腔感染雞免疫病理變化的比較
　　 本實(shí)驗(yàn)將JS、CAT、CN和RH弓形蟲蟲株腹腔感染雛雞，對(duì)雞感染弓形蟲后的免疫病理變化進(jìn)

17、行比較。300只10日齡雛雞隨機(jī)分成5個(gè)組，每組60只，分別命名為JS，CAT, CN，RH和陰性對(duì)照組，JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×107的劑量腹腔感染雛雞，陰性對(duì)照組僅注射PBS。感染后分別在第0天，4天，11天，25天，39天和53天采血和脾臟，分離血清和脾臟淋巴細(xì)胞，每組取10只。弓形蟲循環(huán)抗原和特異性的抗體（IgA，IgG和IgM）利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè);脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+，CD8+以及MHCⅠ和MHCⅡ類分

18、子的變化利用流式技術(shù)進(jìn)行檢測(cè);細(xì)胞因子IFN-丫，IL-12，IL-4，IL-10和IL-17利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè);血清鐵、血清中NO和iNOS的活性利用比色法進(jìn)行檢測(cè);血細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞利用血細(xì)胞分析儀直接測(cè)定。感染組高水平的IgM，IgG和IgA分別在感染后第4天，第11天和第11天出現(xiàn)，并持續(xù)至39、53和39天;不同感染組CD4+T細(xì)胞分別在第4天和第11天顯著上升，至53天時(shí)與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異;

19、CD8+T細(xì)胞和MHCⅠ類分子在第4天顯著上升，至53天時(shí)，CD8+T細(xì)胞仍顯著高于陰性對(duì)照組，而MHCⅠ類分子在39天時(shí)與陰性對(duì)照組差異不顯著;MHCⅡ類分子在第4天顯著上升又在25天時(shí)顯著下降，至53天時(shí)與陰性對(duì)照組差異不顯著;IFN-γ，IL-12，IL-10和IL-17分別在感染后第4天顯著上升，25天時(shí)，感染組IFN-γ和IL-10與陰性對(duì)照組差異不顯著，而感染組IL-12至53天時(shí)仍顯著高于陰性對(duì)照組，IL-17則無(wú)顯著差異

20、;4個(gè)感染組IL-4自始至終均無(wú)顯著變化;感染組NO，血清鐵以及iNOS的活力在第4天顯著上升，又在第39天后與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異。這些都反應(yīng)了雞感染弓形蟲后的免疫病理學(xué)變化。與另外三個(gè)感染組相比，JS組具有更高水平的CD4+，CD8+T細(xì)胞，IFN-γ，IL-12，IL-10，NO和更高活力的iNOS，這說(shuō)明其差異可能與蟲株的來(lái)源有關(guān)。與腹腔感染小鼠的結(jié)果相比，IgG抗體的產(chǎn)生，感染早期顯著上升的MHCⅡ，較早產(chǎn)生的IFN-γ、IL