Tregs調(diào)控瘧疾保護(hù)性免疫應(yīng)答和免疫病理效應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病?！禢ature》公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界上100多個(gè)國(guó)家為瘧疾流行區(qū)，約22億人口受到瘧疾的威脅，每年有300～500萬瘧疾臨床病例，病死人數(shù)高達(dá)110～270萬。為此，2003年WHO將瘧疾作為優(yōu)先重點(diǎn)防治的感染性疾病。在中國(guó)，盡管在控制瘧疾流行、減少危害程度方面取得了顯著成效，但由于耐藥性原蟲和耐殺蟲劑性蚊的普遍出現(xiàn)，以及近年來流動(dòng)人口劇增、氣候變

2、暖和生態(tài)環(huán)境變化等因素，疫情狀況依然十分嚴(yán)峻。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)顯示，2000年以來我國(guó)瘧疾發(fā)病人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，現(xiàn)有21個(gè)省(直轄市、自治區(qū))的907個(gè)縣有瘧疾病例報(bào)告，受瘧疾威脅人口高達(dá)5.5億。因此，有效的瘧疾疫苗和抗瘧新藥的研制開發(fā)已經(jīng)成為當(dāng)今世界迫切需要解決的重點(diǎn)課題，而瘧原蟲感染宿主機(jī)體應(yīng)答的免疫學(xué)、分子生物學(xué)等綜合基礎(chǔ)研究是其重要前提。 瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，需要通過免疫效應(yīng)機(jī)制對(duì)其控制和消除。同時(shí)，由于過強(qiáng)

3、的炎癥反應(yīng)引起腦瘧等免疫病理?yè)p傷也是這一疾病的突出特征。關(guān)于紅內(nèi)期瘧原蟲感染的免疫機(jī)制，無論鼠瘧模型和人體試驗(yàn)研究結(jié)果均已證實(shí)：①CD4+T細(xì)胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在感染早期，Th1型細(xì)胞經(jīng)DC分泌的IL-12誘導(dǎo)活化，產(chǎn)生以IFN—γ為主的炎癥性細(xì)胞因子，遏制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖；隨之，由Th2型細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，能夠有效地清除瘧原蟲，防止復(fù)發(fā)和再燃。由此表明：抗瘧保護(hù)性免疫有賴于Th1和Th2型

4、免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡。②Th1/Th2型免疫應(yīng)答的發(fā)生時(shí)相和效應(yīng)強(qiáng)度明顯地影響著最終的感染結(jié)局。各種數(shù)據(jù)顯示，致死型腦瘧等嚴(yán)重并發(fā)癥的出現(xiàn)與機(jī)體過強(qiáng)的Th1型炎癥應(yīng)答密切相關(guān)。由此提示：維持前炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子之間的動(dòng)態(tài)平衡，控制炎癥性細(xì)胞因子產(chǎn)生的時(shí)間和強(qiáng)度對(duì)瘧疾感染甚為關(guān)鍵。打破免疫應(yīng)答之間的平衡或擾亂免疫應(yīng)答的時(shí)間進(jìn)程，均可能導(dǎo)致慢性感染或者病情加重。換言之，在決定瘧疾感染最終結(jié)局方面，調(diào)控瘧疾感染的免疫應(yīng)答與誘

5、導(dǎo)有效的抗瘧免疫同樣重要。然而，目前關(guān)于保護(hù)性和病理性免疫應(yīng)答動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。 CD4+T細(xì)胞亞類CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是一類具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞群，體內(nèi)、外試驗(yàn)顯示，Tregs具有廣泛的免疫抑制性，通過表面膜分子與其它細(xì)胞直接接觸、或分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β兩種方式，可抑制體內(nèi)天然CD4+T和CD8+T細(xì)胞等多種細(xì)胞的活化和增殖。目前，對(duì)Tregs的研究主要集中于自身免

6、疫性疾病、抗移植和抗腫瘤免疫等方面，而在瘧疾等感染性疾病中作用的研究才剛剛起步，特別是關(guān)于Tregs對(duì)Th應(yīng)答效應(yīng)和Th1/Th2極化機(jī)制方面的研究尚未深入開展。有限的研究結(jié)果顯示，在感染致死型伯氏瘧原蟲(Plasmodium． berghei NK65)或約氏瘧原蟲(p.yoelii17XL)之前，應(yīng)用抗CD25單克隆抗體耗竭小鼠體內(nèi)Tregs，可通過延緩瘧原蟲的增殖速率使其致死性感染得以控制。Tregs回輸實(shí)驗(yàn)證實(shí)，p.yoelii

7、17XL感染能夠特異性活化Tregs，介導(dǎo)瘧原蟲逃逸C57BL/6小鼠的T細(xì)胞應(yīng)答。同樣人體實(shí)驗(yàn)也表明惡性瘧原蟲(P。falciparum)感染誘導(dǎo)Tregs分化并伴有IL-10的升高。以上結(jié)果均提示，Tregs的活化是介導(dǎo)惡性瘧原蟲和致死型嚙齒類瘧原蟲逃逸機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。 另外，人們研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞亞群分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子也具有重要的調(diào)節(jié)作用。T—bet和GATA3是兩種細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，分別特異性地表達(dá)于Th1和Th2細(xì)胞

8、。T—bet正調(diào)控Th1細(xì)胞的發(fā)育，GATA3正調(diào)控Th2細(xì)胞的發(fā)育，二者最終決定Th0向Th1/Th2的轉(zhuǎn)化。由此可以看出在瘧疾感染過程中T—bet和GATA3兩種轉(zhuǎn)錄因子也參與了Th1/Th2的極化過程。 為了解不同瘧原蟲感染過程中Th1/Th2應(yīng)答的差異是否與Tregs的免疫調(diào)節(jié)作用具有一定的相關(guān)性，本研究選用致死型約氏瘧原蟲(p.yoelii17XL，Py17XL)、夏氏瘧原蟲(p.chabaudi AS，p.cAS)及

9、其約氏+夏氏瘧原蟲(1:1)混合感染DBA/2和BALB/c小鼠，動(dòng)態(tài)觀察感染過程中Th1/Th2應(yīng)答的差異、Tregs的數(shù)量變化和功能特點(diǎn)，并且在此基礎(chǔ)上應(yīng)用抗CD25單克隆抗體阻斷技術(shù)，以期闡明Tregs在瘧疾感染過程中的作用地位及其相關(guān)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其模型構(gòu)建 6—8周齡、雌性DBA/2和BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔分別感染1×106 p.y17XL、PcAS和2×106 p.y17XL+P

10、cAS(1:1)寄生的紅細(xì)胞(PRBC)，構(gòu)建不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 2、采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)小鼠感染瘧原蟲后IFN—γ和IL—4的含量 無菌取出感染小鼠脾臟，制成細(xì)胞懸液并調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml，24孔培養(yǎng)板上加入細(xì)胞懸液，500μl/孔，于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清，—80℃保存，待IFN—γ和IL—4檢測(cè)。 用雙抗體夾心ELISA法對(duì)IFN—γ和IL—4的含量

11、進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處OD值，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。 3、采用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子T—bet和GATA3 mRNA的表達(dá)水平 4、采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)小鼠感染瘧原蟲后脾Tregs及CD4+T細(xì)胞凋亡的百分比 5、采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)小鼠感染瘧原蟲后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的含

12、量 無菌取小鼠脾臟，制成1×107/ml脾細(xì)胞懸液。24孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液，500μl/孔，于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清。用雙抗體夾心ELISA法對(duì)TGF-β和IL-10的含量進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處OD值。應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。 6、采用細(xì)胞內(nèi)染色方法檢測(cè)小鼠感染瘧原蟲后分泌IL-10的Tregs數(shù)

13、量的百分比 無菌取小鼠脾臟，制成1×107/ml脾細(xì)胞懸液。于流式管中加入細(xì)胞懸液，500μl/管，37℃條件下PMA和伊屋諾霉素刺激2h后加入Golgi Stop共同培養(yǎng)4h，3％FCS洗滌后加入FITC—anti—CD4 and PE—anti—CD25熒光抗體，4℃孵育30min，3％FCS洗滌后加入固定透膜劑，4℃孵育20min，洗滌后加入APC—anti—IL-10(JES5—16E3)熒光抗體，4℃避光孵育30min

14、，洗滌后上機(jī)。同時(shí)用FITC rat IgG2b作為同型對(duì)照。 7、應(yīng)用抗CD25單克隆抗體阻斷技術(shù)，研究Tregs在約氏瘧原蟲感染早期相關(guān)的作用機(jī)制 BALB/c小鼠分別在感染前1d和感染后1d腹腔注射1mg的抗CD25 mAb(7D4)，腹腔注射PBS小鼠作為對(duì)照組。分別于感染0d、3d和5d常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tregs體內(nèi)消除后數(shù)量及其CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量變化；收集脾細(xì)胞培養(yǎng)上清待Tregs體內(nèi)

15、消除后IFN—γ和IL-10水平檢測(cè)。 結(jié)論： 1、p.y17XL和p.cAS感染過程中，小鼠DBA/2和BALB/c免疫應(yīng)答存在明顯差異。 2、p.y17XL和p.cAS感染過程中，Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡對(duì)抵抗瘧疾感染至關(guān)重要，同時(shí)提示Th1和Th2型免疫應(yīng)答的發(fā)生時(shí)相和效應(yīng)強(qiáng)度可能最終影響著瘧疾感染結(jié)局。 3、Tregs數(shù)量的過早升高與p.y17XL感染的BALB/c小鼠Th1型

16、免疫應(yīng)答未能有效建立密切相關(guān)； 4、Tregs數(shù)量的異常活化與p.cAS感染的DBA/2小鼠未能成功的從Th1向Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)化密切相關(guān)； 5、p.y17XL+p.cAS混合感染過程中，DBA/2和BALB/c小鼠免疫應(yīng)答模式與p.y17XL單獨(dú)感染DBA/2和BALB/c小鼠的應(yīng)答模式相同； 6、p.y17XL+PcAS混合感染過程中，Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡對(duì)抵抗瘧疾感染至關(guān)重要；