豬傳染性胃腸炎病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種高度接觸性傳染性疾病，臨床表現(xiàn)為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水。TGEV對(duì)首次感染的豬群造成的危害尤其嚴(yán)重，2周齡以內(nèi)仔豬死亡率可以達(dá)到90％-100％，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。TGE臨床癥狀與豬輪狀病毒(PRV)感染和豬流行性腹瀉(PED)等腹瀉性疾病難以區(qū)分，而且經(jīng)常出現(xiàn)混合感染，這為臨床診斷帶來(lái)了很大的困難。常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法不僅耗時(shí)耗力還需要特殊的儀器，在基層中難以展

2、開(kāi)，所以建立一種TGEV的方便快速的檢測(cè)方法十分必要。
　　本試驗(yàn)建立了一種利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù)來(lái)檢測(cè)TGEV的快速檢測(cè)方法，對(duì)該方法進(jìn)行了溫度與時(shí)間的優(yōu)化，并對(duì)該檢測(cè)方法的特異性與靈敏性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。針對(duì)TGEVN基因序列上的六個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)了四條RT-LAMP引物，建立針對(duì)TGEVN基因的RT-LAMP檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法在63℃恒溫下作用50min，使TGEVN基因獲得了最高效率的特異性擴(kuò)增，未見(jiàn)與P

3、EDV等其他豬源易感病毒出現(xiàn)交叉反應(yīng)，具有很好的特異性;同時(shí)該檢測(cè)方法具有極高的靈敏性，最低可檢測(cè)到1.314fg/μL的目標(biāo)病毒DNA，比普通的PCR靈敏度高三個(gè)數(shù)量級(jí);反應(yīng)結(jié)束后可以通過(guò)加入SYBR GreenⅠ熒光染料在紫外燈下觀察反應(yīng)管的顏色變化來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色熒光，陰性擴(kuò)增產(chǎn)物為橙色。從哈爾濱周邊豬場(chǎng)收集47份臨床樣品RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果與已得到驗(yàn)證的RT-PCR和ELISA結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示