基于RT-LAMP的口蹄疫病毒(FMDV)通用型快速檢測(cè)方法構(gòu)建.pdf

1、口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus, FMDV）引起的一種動(dòng)物傳染性疫病，主要侵染偶蹄類動(dòng)物，以豬，牛，羊易感，偶見(jiàn)于人和其他動(dòng)物。FMD致死率較高，幼年個(gè)體死亡率高達(dá)100％，感染后常不見(jiàn)癥狀而猝死，成年個(gè)體死亡率較低。目前，F(xiàn)MD對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)及人類健康構(gòu)成巨大威脅，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International des

2、 Epizooties, OIE）法定報(bào)告的動(dòng)物傳染病之一。
　　FMDV為RNA病毒，變異較快，給疫苗研制帶來(lái)巨大困難。病原學(xué)檢測(cè)，血清學(xué)檢測(cè)，分子生物檢測(cè)等是常見(jiàn)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，但技術(shù)要求高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，在基層單位檢測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中應(yīng)用受限。
　　逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reverse transcription loop mediacted isothermal amplification, RT-LAMP）是一種

3、新技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速，僅需一個(gè)水浴鍋，在一個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以完成核酸的檢測(cè)。據(jù)此原理，本研究探索并建立了FMDV通用型RT-LAMP快速檢測(cè)方法。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1）引物設(shè)計(jì)：對(duì)O型，A型及亞洲Ⅰ型3種血清型FMDV全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件primer explorer V5，設(shè)計(jì)40套R(shí)T-LAMP引物，根據(jù)LAMP評(píng)分原則等方法篩選出3套特異性引物，初步建立了FMD通用型R

4、T-LAMP檢測(cè)方法。
　　2）方法優(yōu)化：為提高RT-LAMP檢測(cè)效率，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最終確立的25μL的RT-LAMP最佳反應(yīng)體系為：外引物（F3/B3）各12 mM，內(nèi)引物（FIP/BIP）各40mM，環(huán)引物（LF/LB）各35mM，鎂離子的濃度8 mM，甜菜堿的濃度為0.24 M，dNTP的濃度1.8 mM，BstDNA大片段聚合酶濃度6.4 U/μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶的濃度為0.16 U/μL，10×BstDNA大片段

5、聚合酶Buffer添加量2.5μL，染料添加量1μL，模板添加量2μL并用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)程序?yàn)椋?3℃，60 min；80℃，10min。
　　3）敏感性檢測(cè)：利用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（簡(jiǎn)稱蘭獸研）提供的7種FMD代表毒株作為RT-LAMP敏感性檢測(cè)方法的模板，同時(shí)利用蘭獸研的FMD熒光檢測(cè)試劑盒作對(duì)比，本研究的ΔRn值高于蘭獸研檢測(cè)ΔRn值， RT-LAMP檢測(cè)方法敏感性高于蘭獸研 FMD熒光檢測(cè)試劑盒

6、敏感性。并且本研究方法對(duì)于目前國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的O型FMDV毒株Mya-98和PanAsia，及A型毒株Sea-97 G2的敏感性較好。
　　4）靈敏度檢測(cè)：本研究所建立的檢測(cè)方法能夠同時(shí)檢測(cè)出三種血清型
　　FMDV，對(duì)O型的檢測(cè)靈敏度最高。分別以10倍梯度稀釋的O型，A型及亞洲Ⅰ型3種血清型FMDV核酸作模板，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，其檢測(cè)下限分別是10-6，10-4和10-2。通過(guò)與OIE RT-qPCR檢測(cè)方法、蘭獸研FMDV檢測(cè)試

7、劑盒和中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（簡(jiǎn)稱疫控中心）RT-PCR方法作對(duì)比，O型檢測(cè)靈敏度高于OIE RT-qPCR檢測(cè)方法3個(gè)數(shù)量級(jí)，高于蘭獸研FMDV檢測(cè)試劑盒2個(gè)數(shù)量級(jí)，與疫控中心RT-PCR法接近；A型檢測(cè)靈敏度高于OIE RT-qPCR檢測(cè)方法和疫控中心 RT-PCR法2個(gè)數(shù)量級(jí)，與蘭獸研FMDV檢測(cè)試劑盒接近；亞洲Ⅰ型檢測(cè)靈敏度稍低于其它檢測(cè)方法。
　　5）特異性檢測(cè)：本方法特異性強(qiáng)，分別以O(shè)型，A型和亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸

8、、豬瘟病毒（classical swine fevervirus,CSFV）、豬圓環(huán)病毒（porci ne circovirus,PCV）、豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus,PPV）、豬偽狂犬病毒（p orcine pseudorabies virus,PRV）、豬藍(lán)耳病毒（porcine reproductive and respir atory syndromevirus,PRRSV）、副豬嗜血桿菌（haemophi