枇杷花粉管生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因片段的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、花粉管作為雄性生殖單位的載體，其萌發(fā)及伸長(zhǎng)是開花植物有性生殖的重要階段，并在植物授粉受精過程中起到了重要的作用。二倍體和天然三倍體枇杷在生殖發(fā)育過程存在較大的差異，三倍體枇杷在減數(shù)分裂、授粉受精過程中存在異?，F(xiàn)象，其中大部分花粉管萌發(fā)和伸長(zhǎng)受阻?；ǚ酃苌L(zhǎng)發(fā)育受眾多基因調(diào)控，而三倍體枇杷花粉管生長(zhǎng)發(fā)育受阻可能與其過程中部分的基因表達(dá)差異有關(guān)。因此，研究三倍體枇杷花粉管生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制，對(duì)三倍體枇杷生殖發(fā)育相關(guān)研究提供重要參考，且對(duì)研究多

2、倍體植物授粉受精調(diào)控機(jī)理具有重要的生物學(xué)意義。
　　本研究在“龍泉1號(hào)”二倍體(B2)和天然三倍體突變體(B355)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)字表達(dá)譜分析的基礎(chǔ)上，篩選與花粉管生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的5個(gè)基因進(jìn)行片段克隆;利用生物信息學(xué)分析5個(gè)基因片段的生物學(xué)特性;并利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(qRT-PCR)技術(shù)進(jìn)行5個(gè)基因片段的時(shí)空表達(dá)特性分析。以期探討這些基因在不同倍性枇杷花粉管生長(zhǎng)發(fā)育過程中的表達(dá)差異，明確其在不同倍性枇杷中的表達(dá)模式，從而為三倍體

3、枇杷花粉管生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因篩選和進(jìn)一步分析三倍體枇杷育性網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)理研究提供參考。本研究取得的主要結(jié)果如下:
　　1、B2和B355花粉管生長(zhǎng)發(fā)育差異基因的篩選
　　在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)字表達(dá)譜分析的基礎(chǔ)上，對(duì)2413個(gè)B2和B355的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，從中找到18個(gè)與花粉管相關(guān)的基因，并篩選出5個(gè)信息詳盡且在不同倍性中表達(dá)差異較大的基因，即CL1893，CL13463，CL12486，CL9564和Unigene4

4、683基因作為克隆候選序列。
　　2、枇杷CL1893，CL13463，CL12486，CL9564和Unigene4683基因片段克隆
　　①序列長(zhǎng)度為1034bp的CL1893基因片段，與富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶(the leucine-rich repeats receptor-likeprotein kinase，LRR-LK)高度同源，預(yù)測(cè)該基因可能位于花粉管頂端，參與花粉管的生長(zhǎng)發(fā)育過程;②序列長(zhǎng)度分別為426

5、bp和736bp的CL13463片段和CL9564片段，初步判斷二者可能為ANX1和ANX2的同源基因，可能具有維持花粉管形態(tài)的功能;③序列長(zhǎng)度為972bp的CL12486片段為鳥嘌呤核苷酸交換因子(Rho-GEF)的同源基因，預(yù)測(cè)它參與花粉管的生長(zhǎng);④序列長(zhǎng)度為740bp的Unigene4683片段為果膠酯酶同源基因片段，該基因可能參與調(diào)控花粉管的生長(zhǎng)速度。上述5個(gè)基因片段的功能預(yù)測(cè)顯示，均與花粉管生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。
　　3、CL1

6、893，CL13463，CL12486，CL9564，Unigene4683基因日寸空表達(dá)分析
　　5個(gè)基因的熒光定量結(jié)果顯示它們的表達(dá)模式相似，并且均與枇杷花粉管生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。 CL1893，CL13463，CL12486，CL9564，Unigene4683基因在二倍體和三倍體枇杷中的表達(dá)模式不一致。所有基因在“龍泉1號(hào)”二倍體枇杷的表達(dá)量整體高于三倍體;基因在二倍體枇杷花粉做父本的材料中的表達(dá)量高于以三倍體枇杷花粉作父本;基