核桃花粉管通道法基因轉化效率因子的研究.pdf

1、本研究以清香核桃種胚為試材，對離體胚培養(yǎng)進行研究，以提高胚的萌發(fā)成苗率和繼代增殖效果；以遼寧5號繼代苗和清香種胚為試材，研究潮霉素和卡那霉素對核桃繼代苗生長和種胚萌發(fā)的影響，進行適宜選擇壓的篩選，為今后核桃遺傳轉化研究打下良好的基礎；以核桃品種中林1號、綠波、晉龍、清香等為試材，采用花粉管通道法將外源基因導入核桃中，對外源DNA濃度、導入時間、導入方法等因素進行系統(tǒng)研究，為進一步提高花粉管通道法進行核桃遺傳轉化的效率奠定基礎；
　

2、　 主要結果如下：
　　 1.核桃離體胚培養(yǎng)：胚萌發(fā)階段以DKW培養(yǎng)基+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA 0.01mg/L+白砂糖45～55g/L有利于胚萌發(fā)，不定芽分化多，增殖效果最好。種胚萌發(fā)后頂芽和兩側的不定芽以6-BA1.0～1.5mg/L配合IBA 0.03mg/L有利于胚培苗增殖擴繁。
　　 2.核桃繼代苗和種胚對抗生素的敏感性測定：遼寧5號核桃繼代苗在含Hyg18mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，植株明顯褐化

3、死亡，在含Kan300mg/L的培養(yǎng)基上生長受抑制，全部白化；清香核桃種胚在Hyg20mg/L時種胚褐化，在Kan150mg/L種胚無分化，呈短縮的白色錐體狀。
　　 3.制作熒光切片觀察授粉后花粉的萌發(fā)和伸長情況。外源DNA溶液的滴加時間宜在授粉后14～48h，此時花粉管通道已經(jīng)打開，有利于DNA的導入；子房注射的時間宜在授粉后24～48h，此時花粉管到達胚囊。
　　 4.利用花粉管通道法將農(nóng)桿菌AGL1的質(zhì)粒DNA導

4、入四個核桃主栽品種中，結果表明：不同導入方法在受體當代結實率上存在較明顯的差異，其中子房注射法結實率低于滴加法，達到顯著水平。導入方法宜采用切割柱頭滴加法，既能保證坐果率，又有利于外源DNA溶液導入胚囊。
　　 5.外源DNA濃度為200μg/mL和500μg/mL時結實率和果實子葉GUS基因瞬時表達率較高，濃度增加結實率和GUS基因瞬時表達率降低。
　　 6.轉化果實胚培養(yǎng)成苗后經(jīng)Hyg15mg/L的繼代培養(yǎng)基上進行抗