PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1α對細(xì)胞SUMO化修飾的影響.pdf

1、SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修飾是一種廣泛存在于真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。有報道顯示，一些病毒編碼的蛋白能夠利用SUMO化修飾系統(tǒng)對宿主蛋白的亞細(xì)胞定位、穩(wěn)定性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面進(jìn)行調(diào)節(jié)，抑制或逃逸宿主的免疫反應(yīng)，從而調(diào)控病毒的增殖。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porc

2、ine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的免疫抑制性疾病。PRRSV編碼的Nsp1α是一種多功能的非結(jié)構(gòu)蛋白。通過生物學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)PRRSV Nsp1α具有被SUMO修飾的潛在位點，但Nsp1α是否真正被SUMO修飾尚需實驗驗證。本研究從SUMO化修飾這一新的角度探討PRRSV Nsp1α的生物學(xué)功能。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.Nsp1α與SUMO化修飾系

3、統(tǒng)相關(guān)蛋白PIAS1、UBC9的相互作用分析
　　構(gòu)建與SUMO化修飾相關(guān)的結(jié)合酶UBC9和連接酶PIAS1酵母重組質(zhì)粒，經(jīng)檢測證實重組質(zhì)粒pGADT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9無酵母毒性及自激活性。利用酵母雙雜交技術(shù)分析Nsp1α是否與PIAS1、UBC9存在相互作用。結(jié)果顯示，在酵母系統(tǒng)中，Nsp1α與PIAS1發(fā)生相互作用，但與UBC9不存在相互作用。為了進(jìn)一步驗證Nsp1α是否能與PIAS1在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)生相

4、互作用，在HEK-293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Nsp1α和PIAS1的真核表達(dá)質(zhì)粒，免疫共沉淀實驗的結(jié)果表明，Nsp1α與PIAS1不存在直接的相互作用。
　　2.Nsp1α SUMO化修飾的檢測
　　雖然免疫共沉淀實驗證實Nsp1α與PIAS1不存在直接的相互作用，但考慮到生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果，我們還是進(jìn)一步分析了Nsp1α是否被SUMO化修飾。在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-Nsp1α、 pCAGGS-Myc-S

5、UMO1和pcDNA-His-UBC9三種真核表達(dá)質(zhì)粒，通過免疫共沉淀檢測Nsp1α是否存在SUMO化修飾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nsp1α沒有被SUMO化修飾。
　　3.Nsp1α阻礙細(xì)胞內(nèi)SUMO化修飾水平
　　既然Nsp1α不存在SUMO化修飾，那么Nsp1α是否調(diào)控宿主蛋白的SUMO化修飾水平呢？為了探討這一問題，將不同劑量的Nsp1α真核表達(dá)質(zhì)粒和SUMO1真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過Western Blot分析細(xì)

6、胞的SUMO修飾水平。結(jié)果顯示:細(xì)胞內(nèi)的SUMO化修飾水平受到顯著的抑制，且與Nsp1α的表達(dá)呈劑量依賴性，表明Nsp1α具有去SUMO的特性。根據(jù)Nsp1α晶體結(jié)構(gòu)和實驗室已有的Nsp1α截短突變體，進(jìn)一步探討了Nsp1α阻礙細(xì)胞內(nèi)SUMO化修飾的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，Nsp1α的鋅指基序ZF1結(jié)構(gòu)域在這一過程中起著關(guān)鍵作用。
　　4.Nsp1α通過阻礙IRF3的SUMO化修飾，促進(jìn)IRF3的降解
　　以前的研究證實PRR

7、SV Nsp1α能夠拮抗RIG-Ⅰ介導(dǎo)的β-干擾素(IFN-β)產(chǎn)生。為了探討Nsp1α去SUMO修飾是否在其拮抗IFN中發(fā)揮作用，將Nsp1α真核表達(dá)質(zhì)粒與編碼RIG-Ⅰ通路中關(guān)鍵信號分子(RIG-Ⅰ、IPS-1、TBK1、IRF3)的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示:Nsp1α抑制IFN-β的作用靶點為轉(zhuǎn)錄因子IRF3;超表達(dá)Nsp1α后，IRF3的SUMO化修飾水平顯著降低，而且IRF3的

8、穩(wěn)定性減弱。這說明，Nsp1α能夠通過阻礙IRF3的SUMO化修飾，促進(jìn)IRF3的降解，從而抑制IFN-β的產(chǎn)生。
　　5.Nsp1α賴氨酸位點的分析
　　賴氨酸(K)殘基在許多蛋白的翻譯后修飾中發(fā)揮重要作用。為了分析Nsp1α的賴氨酸殘基對其去SUMO化修飾功能的影響，進(jìn)一步構(gòu)建了Nsp1α的突變體K117A、K150A、K169A，在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)這些突變體。Western Blot結(jié)果表明，Nsp1α的三個

9、賴氨酸位點均負(fù)調(diào)控其阻礙細(xì)胞SUMO化修飾。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果也進(jìn)一步表明，Nsp1α的賴氨酸位點對其抑制IFN-β啟動子具有負(fù)調(diào)控的作用，且能抑制組成性激活體IRF3-5D誘導(dǎo)的IFN-β啟動子的激活。
　　綜上所述，本研究證實Nsp1α不能被SUMO修飾，卻意外發(fā)現(xiàn)Nsp1α能夠阻礙細(xì)胞內(nèi)蛋白的SUMO化修飾。更有意義的是，Nsp1α通過阻礙干擾素信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF3的SUMO化修飾并促進(jìn)其降解，從而拮抗Ⅰ型干