利用病毒假型技術(shù)研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒次要結(jié)構(gòu)蛋白的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起豬的烈性傳染病，在分類地位上屬于套式病毒目，動(dòng)脈炎病毒科，動(dòng)脈炎病毒屬，不分節(jié)段，有囊膜的單股正鏈RNA病毒。是能夠引起母豬繁殖障礙和新生仔豬呼吸癥狀的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原。假型病毒是指一種反轉(zhuǎn)錄病毒的囊膜糖蛋白被另外一種病毒的囊膜蛋白所代替，而基因組仍保持反轉(zhuǎn)錄病毒本身的特性。帶有異源性病毒囊膜糖蛋白的假型病毒作為研究病毒的侵入模型是非常安全的，因?yàn)槠鋬H能引起單循環(huán)感染，能夠獲得

2、異源性病毒的宿主范圍，因此便于研究病毒的侵入機(jī)制、組織嗜性、中和抗體分析以及受體的鑒定等。 目前，PRRSV分子生物學(xué)方面已進(jìn)行的大多數(shù)研究都針對(duì)其主要結(jié)構(gòu)蛋白，特別是針對(duì)囊膜蛋白GP5的研究，本實(shí)驗(yàn)室也利用病毒假型技術(shù)成功構(gòu)建了PRRSVGP5的MuLV假型病毒體系。但對(duì)PRRSV次要結(jié)構(gòu)蛋白的研究相對(duì)較少，本試驗(yàn)利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)擴(kuò)增了PRRSV次要結(jié)構(gòu)蛋白GP2、GP3、GP4基因，并將GP2、GP3、GP4基因分別克隆

3、至真核表達(dá)載體pcDNA3.0中，構(gòu)建含次要結(jié)構(gòu)蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-GP2、pcDNA-GP3、pcDNA-GP4，分別運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以空載體pcDNA3.0轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以pcDNA-GP5（由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保存）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。48h后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別與PRRSV特異性多抗及FITC標(biāo)記的羊抗豬二抗反應(yīng)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，與陰性對(duì)照值0.7％相比，

4、陽(yáng)性對(duì)照pcDNA-GP5的表達(dá)量是最高的，達(dá)到30.4％，GP2、GP3和GP4重組質(zhì)粒僅得到少量表達(dá)，分別為4.9％、5.4％、7.6％。 用pcDNA-GP2、pcDNA-GP3、pcDNA-GP4分別與鼠白血病病毒（MuLV）病毒假型構(gòu)建體系的兩種質(zhì)粒pHIT60（包括MuLV的結(jié)構(gòu)蛋白基因，即gag和pol）和pHIT111（為MuLV的基因組及報(bào)告基因LacZ）瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T，48小時(shí)后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清

5、液，超速離心濃縮上清液，利用PRRSV特異性多抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗通過Western-blot檢測(cè)，結(jié)果未能檢測(cè)到GP2、GP3、GP4在此濃縮液中表達(dá)，說明PRRSV次要結(jié)構(gòu)蛋白不能整合到病毒粒子表面。通過轉(zhuǎn)染上清液感染Marc-145細(xì)胞和豬肺巨噬細(xì)胞（PAM）等不同的靶細(xì)胞，用缺乏囊膜蛋白和已經(jīng)證實(shí)可以形成MuLV假型病毒的水泡性口炎病毒糖蛋白G（VSV-G）作陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果未能檢測(cè)到報(bào)告基因LacZ在此轉(zhuǎn)染上清液中的表達(dá)