豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3和ORF5基因的克隆及在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，主要引起母豬繁育障礙和仔豬及生長(zhǎng)豬呼吸系統(tǒng)疾病。PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，含有8個(gè)開放閱讀框，其中由ORF3編碼的GP3蛋白是PRRSV的次要結(jié)構(gòu)蛋白，在毒株間保守性差，在病毒的致病性、病毒復(fù)制、病毒裝配、病毒變異和保護(hù)性等方面可能具有重要意義。由ORF5基因編碼病毒的糖基化包膜蛋白(E蛋白)，是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與細(xì)胞免疫與體液免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。因此研究ORF

2、3、ORF5基因的克隆及表達(dá)，對(duì)于研制新型疫苗和特異診斷抗原具有重要意義。本試驗(yàn)構(gòu)建了重組克隆載體T-ORF3、T-ORF5，并將ORF3、ORF5分別克隆到桿狀病毒表達(dá)載體中，在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)，為后續(xù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。具體操作如下：
　　 1.本試驗(yàn)從蘭州某豬場(chǎng)采集感染PRRSV的豬肺臟組織，提取總RNA，根據(jù)GenBank中公布的PRRSV中國(guó)代表株Ch-1a基因序列，設(shè)計(jì)包含完整ORF3、ORF5序列的2對(duì)特異引物，利

3、用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增ORF3、ORF5基因，將產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組克隆載體T-ORF3、T-ORF5并進(jìn)行序列測(cè)定?；驕y(cè)序結(jié)果表明克隆得到的ORF3、ORF5基因片段長(zhǎng)度分別為765bp、603bp；同國(guó)內(nèi)外其它13個(gè)代表毒株的核苷酸同源性為88.0％～99.2％、87.3％～99.0％；推導(dǎo)的編碼氨基酸的同源性為86.7％～98.8％、85.6％～98.5％。
　　 2.將ORF3、ORF5分別克隆到桿狀

4、病毒表達(dá)載體pFastBacTMHT A中，獲得重組轉(zhuǎn)座載體pFastBacHTA-ORF3、pFastBacHTA-ORF5，將經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭質(zhì)粒Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，經(jīng)監(jiān)白斑篩選得到含有ORF3、ORF5基因的重組穿梭載體Bacmid-ORF3、Bacmid-ORF5，以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組穿梭載體轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組病毒。PCR鑒定證實(shí)目的基因片段已重組到桿狀病