玉米應(yīng)答低磷脅迫的消減文庫構(gòu)建及部分EST序列分析.pdf

1、磷是植物生長發(fā)育不可缺少的大量元素之一，直接參與植物體內(nèi)各種重要的生理生化過程，對促進(jìn)植物生長發(fā)育和新陳代謝及提高產(chǎn)量起著重要的作用。土壤中磷的總含量非常豐富，但在酸性條件下磷會迅速與陽離子尤其是鋁和鐵離子形成不溶性化合物，致使磷不易被植物吸收，因此土壤缺磷是全球性的問題。土壤中可利用磷的濃度雖然很低，植物在長期適應(yīng)低磷環(huán)境的過程中，已經(jīng)進(jìn)化出了一整套適應(yīng)機制，包括形態(tài)、生長發(fā)育、生化和遺傳上的變化。玉米耐低磷的研究逐漸深入，從耐低磷基

2、因型篩選、形態(tài)、生理生化改變到耐低磷遺傳性狀分析、QTL定位。但有關(guān)玉米耐低磷脅迫下的基因調(diào)控和耐低磷分子機制方面的研究報道還較少。
　　 本研究以耐低磷玉米自交系178為材料，進(jìn)行正常培養(yǎng)和低磷脅迫處理。以低磷處理開始時間為原點，在低磷脅迫6h、12h、24h、48h、72h五個時間點取對照和處理玉米的根系，提取總RNA。然后采用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建玉米根系應(yīng)答低磷脅迫差異表達(dá)基因正向及反向文庫，經(jīng)測序和生物信息學(xué)功能比對后根

3、據(jù)其同源序列基因的功能推測EST序列的功能并進(jìn)行分類注釋；運用RT-PCR半定量表達(dá)技術(shù)，研究具有重要功能的基因在玉米耐低磷響應(yīng)過程中的表達(dá)模式；運用元分析方法及生物信息學(xué)手段，將單拷貝的EST序列和低磷脅迫相關(guān)QTL位點進(jìn)行共定位分析，探討二者之間的吻合程度，分析具有重要遺傳效應(yīng)和育種潛力的EST序列。取得以下研究結(jié)果：
　　 1.通過SSH技術(shù)和文庫構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建了玉米自交系178根系耐低磷差異表達(dá)基因正向文庫和反向文庫，分

4、別包含3648個和2498個克隆。文庫中插入的cDNA片段長度介于100-500bp之間。
　　 2.從正反向文庫中分別選取103個和15個陽性克隆測序后，經(jīng)生物信息學(xué)比對后，共獲得65條唯一的EST序列，其中已知基因功能的EST序列44條，未知功能的EST序列21條。根據(jù)生物信息學(xué)比對同源序列基因的功能并結(jié)合前人的研究，將已知基因功能的44條EST序列分為九類：能量代謝類(2條，3％)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝類(18條，28％)、

5、磷素循環(huán)類(4條，6％)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類(3條，5％)、細(xì)胞分裂和組成類(2條，3％)、脅迫相關(guān)類(5條，8％)、蛋白質(zhì)互作類(1條，1％)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控類(7條，11％)和通道蛋白類(2條,3％)。結(jié)果表明，低磷脅迫下的玉米根系表現(xiàn)出能量代謝加劇、蛋白質(zhì)合成的增加、轉(zhuǎn)錄調(diào)控加強、有機態(tài)磷的分解利用增加和磷素消耗壓縮，發(fā)現(xiàn)根細(xì)胞中存在多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，生長素合成增加導(dǎo)致細(xì)胞分裂加快，根細(xì)胞加強了保護機制以應(yīng)對低磷脅迫對細(xì)胞產(chǎn)生的威脅。
　

6、　 3.通過生物信息學(xué)比對，從65條EST序列中獲得24條單一拷貝EST序列，將單一拷貝EST序列與已報道的低磷脅迫相關(guān)QTL位點都定位在玉米染色體圖譜上，共定位分析表明，45.8％的單拷貝EST序列與QTL位點重疊，表明運用SSH構(gòu)建的低磷脅迫基因差異表達(dá)文庫，能篩選較高比例的具有顯著遺傳效應(yīng)的低磷應(yīng)答相關(guān)基因，具有一定可靠性和合理性?？梢灶A(yù)見，隨著EST序列和QTL位點信息的增加，兩者相互之間的共定位區(qū)域會更加明顯。
　　

7、 4.采用半定量RT-PCR方法，研究來自不同類型的5個重要功能的基因各時間段的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)五個基因表達(dá)量在總體上都呈上升的趨勢，但具體到各個時間段的表達(dá)上又有所差別。根據(jù)5個基因表達(dá)量上調(diào)的時間和增幅的大小，可以初步認(rèn)為玉米根系中5個耐低磷相關(guān)基因的表達(dá)順序為：紫色酸性磷酸化酶前體基因(PAP)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GCS)、假定myb1靶序列基因(TOM)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因(PDI)和生長素誘導(dǎo)蛋白基因(AIP

8、)，表明低磷脅迫下玉米根系內(nèi)的生理生化變化發(fā)生在先：磷的虧缺首先促發(fā)對磷的需求壓力，然后引發(fā)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失衡，需要大量合成相關(guān)蛋白質(zhì)和啟動耐低磷下游基因的調(diào)控子，最后生長素誘導(dǎo)蛋白大量合成引發(fā)了根構(gòu)型改變，因而根構(gòu)型等形態(tài)變化發(fā)生在后，這一結(jié)果與田間觀察結(jié)果以及前人研究結(jié)果基本吻合。
　　 5.本研究運用SSH獲得的結(jié)果與前人運用基因芯片、蛋白質(zhì)組分析、cDNA-AFLP等方法的研究結(jié)果相互映證，也與谷俊濤等(2009年)在小麥

9、上的研究結(jié)果、李利華等(2009年)在水稻上的研究結(jié)果相似。由此可見，運用SSH技術(shù)構(gòu)建低磷脅迫差異表達(dá)基因文庫、研究玉米耐低磷的機理具有較高的可靠性和合理性。
　　 6.從整體看玉米低磷脅迫響應(yīng)涉及根系形態(tài)結(jié)構(gòu)、能量代謝、物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)運輸?shù)榷鄠€方面基因，各方面基因間相互作用、密切聯(lián)系，共同構(gòu)成了玉米低磷響應(yīng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這與前人的研究結(jié)果相一致。
　　 7.低磷脅迫下玉米根系內(nèi)的響應(yīng)過程是一個基

10、因順序啟動的過程：首先是磷素循環(huán)類基因的啟動，然后是脅迫相關(guān)類、氨基酸蛋白質(zhì)代謝類、生長素合成相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶序列基因的啟動，較晚啟動的是根細(xì)胞分裂和組成類。本研究中基因的啟動順序與田間觀察和前人研究結(jié)果中低磷脅迫下玉米根系內(nèi)的生理生化變化發(fā)生8.本研究推測耐低磷玉米的核心適應(yīng)能力表現(xiàn)在磷素循環(huán)、細(xì)胞保護和根構(gòu)型三個主要方面，與前人研究的小麥、水稻耐低磷機制有相似之處。耐低磷玉米三方面的核心適應(yīng)能力與信號傳導(dǎo)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)、氨基