葡萄microRNA及其靶基因的識別、鑒定及作用方式研究.pdf

1、植物microRNA(miRNA)是廣泛分布于植物基因組中的一類長度約19-24個核苷酸的內(nèi)源非編碼的單鏈小分子RNA，是植物基因表達的重要調(diào)節(jié)因子。它主要通過介導靶基因(靶)的裂解或抑制靶的翻譯從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶的表達，在植物的生長、發(fā)育、分化、凋亡、新陳代謝、應激反應等方面起著重要的調(diào)控作用。植物miRNA是植物功能基因組學研究的主要內(nèi)容之一。葡萄(Vitis viniferaL.)是世界性重要水果，也是我國最重要經(jīng)濟果樹之一。目前

2、，盡管已有一些葡萄miRNA識別、鑒定的報道，但所有這些鑒定的葡萄miRNA均來自歐亞種的釀酒葡萄，而且這些歐亞種的不同品種中約30％同源miRNA存在序列差異。因此，在不同葡萄品種群與葡萄種上開展葡萄miRNA及其靶基因的識別、鑒定及作用方式研究對于更全面認識葡萄miRNA的特性，功能及葡萄種間的進化具有重要意義，也為葡萄功能基因組學的全面開展奠定了重要研究基礎。
　　 本研究以歐美雜種(hybrid of V.vinifer

3、a and V.labrusca)的鮮食葡萄‘夏黑’(Summer x Black)和野生的山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)為試驗材料，利用生物信息學預測、miR-RACE、Solexa測序、Degradome測序、qRT-PCR.PPM-RACE和RLM-RACE技術以及等技術系統(tǒng)地開展了葡萄miRNA(Vv-miRNA)及其靶基因的鑒定與特征性分析，并研究了miRNA調(diào)控靶基因的主要作用方式以及作用方式的時空性。

4、主要研究結果如下:
　　 1.利用miR-RACE技術在歐美雜種的鮮食葡萄品種‘夏黑’上驗證了156條生物信息學預測的miRNAs的精確序列，并通過生物信息學方法預測了134條miRNAs的靶基因。進一步對隨機選擇的10對Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄葉、莖、卷須、花序、花和果實六種不同組織中進行熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)表達分析，結果表明不同Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄不同組織具有不同的表達水平，且二者的

5、表達水平之間存在一定的負相關。同源miRNA的靶模式比較分析發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種的同源Vv-miRNAs的堿基變異一般不改變其靶基因，葡萄與擬南芥中同源miRNA序列的堿基變異易改變它們的靶模式。
　　 2.構建了‘夏黑’葡萄不同發(fā)育時期的花序、花、果實小RNA(sRNA)文庫，通過Solexa測序以及miRNA序列的保守性和二級結構的典型性分析，共鑒定了130條保守的Vv-miRNAs和80條潛在的非保守的Vv-miRNAs(包含

6、72條新的Vv-miRNAs和8條已知的非保守的Vv-miRNAs)。在80條非保守Vv-miRNAs中，有42條(52.5％)在葡萄不同組織中表達，其中20條僅有葡萄果實中表達的特異性。利用生物信息學方法預測了56新的Vv-miRNAs的130條靶基因。同源基因的功能注解表明，這些靶基因在葡萄花果發(fā)育以及對環(huán)境脅迫反應的應答過程中可能起著重要作用。
　　 3.為了進一步認識Vv-miRNA調(diào)控靶基因的作用方式，利用5'-RLM

7、-RACE(RNA ligase-mediated5'apid amplification of cDNA ends)和3'-PPM-RACE(Poly(A)polymerase-mediated3'rapid amplification of cDNA ends)技術對21條Vv-miRNA的36條潛在的靶基因及作用方式開展鑒定。結果驗證了18條Vv-miRNAs的31條靶基因并鑒定了它們之間的裂解作用方式及裂解位點，其中約94.4％

8、的Vv-miRNA介導靶基因的裂解位點在miRNA的5'端第10位堿基。Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄8種組織的表達水平之間存在相反的變化趨勢，靶基因裂解產(chǎn)物在這些組織的積累模式與相應的Vv-miRNAs的表達模式基本一致。
　　 4.為了認識原產(chǎn)中國的重要野生葡萄種山葡萄miRNA的功能特性，并進一步研究不同葡萄種同源miRNA的差異，對山葡萄中的小RNA開展了挖掘。通過Solexa測序共鑒定出126條保守miRNAs和3

9、4條非保守miRNAs，發(fā)現(xiàn)了72條新的山葡萄特異miRNAs(Va-miRNAs)。利用miR-RACE技術驗證了40條新的Va-miRNAs的精確序列。通過qRT-PCR檢測到隨機選擇的18條Va-miRNAs在山葡萄7個不同組織的表達。Va-miRNAs在28種植物(包括不同葡萄種群)間具有較高的保守性，但同源miRNAs也存在一定的堿基變異?；诓煌咸逊N間的同源miRNA序列比較，在山葡萄上發(fā)現(xiàn)了的miRNA SNPs(miR

10、-SNPs)和miRNA長度變異(miR-LDs)，其中一些變異可能改變其靶模式。利用生物信息學方法預測了新的Va-miRNAs的346條靶基因。同源基因功能注解表明，它們主要涉及抗逆過程(抗寒性、抗病性、抗旱性等)、花青素合成及糖代謝等過程。
　　 5.為了從全基因組水平全面認識miRNA在葡萄發(fā)育過程中作用模式的時空特性，利用Solexa、Degradome測序及生物信息學方法系統(tǒng)研究了不同發(fā)育時期的葡萄葉、花、果組織中Vv

11、-miRNA與靶基因的特性及Vv-miRNA調(diào)控靶基因作用模式的時空變化。共鑒定了242條已知的和132條新的miRNA，并驗證到193條靶基因，其中103條是已知Vv-miRNA的靶基因，另90條為新Vv-miRNA的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，超過50％的新Vv-miRNA在葡萄花、果組織中特異地表達，并在相應組織對其靶基因有特異性地裂解作用，其中花組織中的靶裂解位點具有廣泛性。qRT-PCR表達分析發(fā)現(xiàn)6條果實的新Vv-miRNA對外源赤霉

12、素(GA)和乙烯處理顯著地響應，表明它們參與了與GA和乙烯信號途徑相關的葡萄果實發(fā)育過程。另一方面，約93.6％的已知miRNA在葡萄發(fā)育過程中通過不同作用模式動態(tài)調(diào)控相應的靶基因，其中不僅存在多個家族的不同成員共同調(diào)控靶基因的模式，而且存在miRNA家族的多個成員中只有一個成員在葡萄發(fā)育過程中對靶基因起主要調(diào)控作用的模式。
　　 本研究較大地豐富了葡萄基因組學研究內(nèi)容，并為葡萄功能基因組學和葡萄花、果發(fā)育的機理研究奠定了重要研