MicroRNA21及其靶基因PDCD4、PTEN在皮膚鱗癌發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、背景：
　　皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneoussquamouscellcarcinoma,CSCC）簡稱皮膚鱗癌，是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，在非黑素細(xì)胞腫瘤性皮膚腫瘤中發(fā)病率僅次于基底細(xì)胞癌，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。CSCC可發(fā)生于任何部位的皮膚或黏膜，常發(fā)生在某些原有皮膚病的癌前疾病的基礎(chǔ)上，或由各種癌前期疾病演變而來，少數(shù)亦可為原發(fā)性皮膚鱗癌。CSCC臨床表現(xiàn)為浸潤性斑塊、結(jié)節(jié)、潰瘍或疣狀增生，具有局部侵襲、復(fù)發(fā)和淋巴及遠(yuǎn)

2、處轉(zhuǎn)移的特征，甚至可引起死亡。CSCC的病理表現(xiàn)為起源于鱗狀上皮細(xì)胞的腫瘤巢，伴有不同程度的細(xì)胞分化，可侵入真皮或更深的組織。高分化的細(xì)胞表現(xiàn)為大的、泡沫狀細(xì)胞核或有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核和大量嗜酸性細(xì)胞質(zhì)，單個(gè)細(xì)胞的角化或腫瘤細(xì)胞癌巢內(nèi)形成角珠是CSCC的特征性標(biāo)志。目前CSCC主要的治療方法有Mohs顯微描記手術(shù)(Mohsmicrographicsurgery)、化療、光動力治療、放射治療、生物治療和免疫治療等，治療方式的選擇應(yīng)根據(jù)病灶的

3、大小、部位、臨床表現(xiàn)、組織病理分級、患者一般情況、患者年齡和病灶類型、原發(fā)、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移等因素進(jìn)行選擇。對病灶較小、分化良好且沒有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CSCC首選Mohs顯微描記手術(shù)治療，切除范圍至少在瘤體外方0.5～2cm，并需要足夠的深度，術(shù)中快速冰凍切片有助于腫瘤的徹底切除，較小的皮損可以直接切除縫合，較大的皮損可以應(yīng)用局部帶蒂皮瓣移植術(shù)，或考慮植皮術(shù)。老年體弱、有手術(shù)禁忌癥以及頭面部結(jié)締組織不多的部位的腫瘤，特別是在腫瘤分化差、腫

4、瘤侵犯骨骼、軟骨或已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下，不適宜行手術(shù)治療，應(yīng)選擇放射治療或其他治療。雖然近年來隨著診療技術(shù)的提高和治療方法的不斷改進(jìn)，CSCC患者的早期診斷率和臨床治愈率大為提高，但較大皮損及轉(zhuǎn)移患者的治療仍是臨床治療的難點(diǎn)。因此對CSCC的發(fā)生機(jī)制、早期診斷和預(yù)防治療是當(dāng)前皮膚腫瘤研究的熱點(diǎn)課題。
　　腫瘤是一種基因病，其發(fā)病是一個(gè)多因素、多階段、復(fù)雜漸進(jìn)的過程，腫瘤發(fā)生是長期的、多步驟、多階段、多種基因突變積累的結(jié)果，腫瘤細(xì)

5、胞來自于正常細(xì)胞，但是腫瘤細(xì)胞具有超過正常的增殖能力，增生與機(jī)體不相協(xié)調(diào)，失去控制。關(guān)于微小RNAs(microRNAs，miRNAs)的研究提示miRNA在腫瘤發(fā)病中起到不可忽視的作用。miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，參與細(xì)胞的生長、分化、增殖、凋亡、個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝等生理過程，miRNAs的異常表達(dá)與多種腫瘤的關(guān)系密切。微小RNA21（microRNA-21，miR-21）是目前發(fā)現(xiàn)的唯

6、一一種在多個(gè)系統(tǒng)多種實(shí)體腫瘤中及血液系統(tǒng)非實(shí)體腫瘤中高表達(dá)的miRNA，也是第一個(gè)在腫瘤病人血清中檢測到的miRNA，其在腫瘤中的表達(dá)異常及其對靶基因的抑制作用在人類miRNAs功能學(xué)的研究中不可忽視。
　　miR-21通過與靶基因mRNA的3'UTR結(jié)構(gòu)相結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)，發(fā)揮其各種重要的功能。miR-21靶基因應(yīng)具有下述3個(gè)特征:1.靶基因的表達(dá)水平與miR-21表達(dá)水平相反，miR-21高表達(dá)時(shí)靶基因低表達(dá)，反之miR

7、-21低表達(dá)時(shí)靶基因高表達(dá);2.靶基因有miR-21的結(jié)合的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，能夠結(jié)合miR-21，當(dāng)miR-21過度表達(dá)或低表達(dá)時(shí)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)構(gòu)建該基因的3'UTR有相應(yīng)變化;3.miR-21靶基因結(jié)合位點(diǎn)缺失或突變時(shí)，miR-21不能發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的作用。miR-21通過對靶基因的調(diào)控調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、血管浸潤和轉(zhuǎn)移。在眾多的靶基因中，程序性細(xì)胞死亡因子4(programmedcelldeath4

8、，PDCD4)和第10號染色體同源丟失性磷酸酶基因和張力蛋白基因(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometengene，PTEN)都是在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要功能的miR-21的靶基因。PDCD4不僅在細(xì)胞程序性死亡過程中起重要調(diào)節(jié)作用，而且通過抑制蛋白翻譯過程對腫瘤細(xì)胞的生長進(jìn)行抑制。作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞因子，PDCD4通過多條信號通路參與、通過眾多癌基因的作用抑制腫瘤的轉(zhuǎn)化、抑

9、制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。PTEN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，通過負(fù)調(diào)控磷酸肌醇-3-激酶/絲氨酸激酶信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、遷移和細(xì)胞凋亡中具有重要的生物學(xué)功能，影響腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移和骨架蛋白的組裝，基因丟失、突變和/或降低表達(dá)引起的PTEN功能缺失已在多數(shù)腫瘤中發(fā)現(xiàn)。PDCD4和PTEN作為腫瘤抑制因子，可以抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，阻止腫瘤發(fā)生，在多種腫瘤細(xì)胞中下調(diào)或缺失，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作

10、用。程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，又稱為細(xì)胞凋亡（apoptosis），在很多腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的程序被打破，DNA發(fā)生損傷或突變，發(fā)生細(xì)胞凋亡不足，從而導(dǎo)致細(xì)胞生存期延長，增殖不受限制。腫瘤是細(xì)胞凋亡異常的疾病，腫瘤細(xì)胞存在細(xì)胞增殖和分化異常，腫瘤的發(fā)生既有細(xì)胞增殖的加速的原因，細(xì)胞死亡的減緩也起到重要作用，細(xì)胞失去控制的生長，凋亡不及，細(xì)胞數(shù)失去相對恒定導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)miR-21在

11、多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，腫瘤細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常，miR-21的靶基因PDCD4和PTEN在腫瘤中也存在表達(dá)異常。然而目前關(guān)于皮膚鱗癌發(fā)病過程中miR-21、其靶基因的作用及其對皮膚鱗癌腫瘤細(xì)胞凋亡的研究甚少。反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)是采用人工合成堿基序列與靶基因或mRNA某一區(qū)段互補(bǔ)的核酸片段，可以通過堿基互補(bǔ)原則結(jié)合于靶基因或mRNA，改變特定蛋白的表達(dá)。
　　為探討mi

12、R-21及其靶基因PDCD4和PTEN在皮膚鱗癌發(fā)病中的作用，本研究檢測了皮膚鱗癌組織及A431細(xì)胞株的miR-21的表達(dá)，皮膚鱗癌組織和A431細(xì)胞中miR-21的靶基因PDCD4和PTEN的蛋白表達(dá)水平及表達(dá)部位，同時(shí)采用反義寡核苷酸技術(shù)對培養(yǎng)的A431細(xì)胞進(jìn)行miR-21的抑制，再檢測miR-21的靶基因PDCD4和PTEN的蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。通過對miR-21及其靶基因在皮膚鱗癌組織及細(xì)胞株中表達(dá)的研究，試圖闡

13、明miR-21的靶基因PDCD4和PTEN在皮膚鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義，為皮膚鱗癌的基因治療提供試驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)研究共分為以下兩部分。
　　第一部分miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN蛋白在皮膚鱗癌組織中的表達(dá)
　　目的：
　　檢測miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN在CSCC及正常皮膚組織中的表達(dá)，了解miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN在CSCC及正常皮膚組織中表達(dá)的差異，

14、探討miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN表達(dá)異常在CSCC發(fā)病機(jī)制中的作用及意義。
　　方法：
　　1.選擇2010年7月至2012年4月皮膚性病科經(jīng)病理確診的CSCC組織標(biāo)本18例，整形外科手術(shù)切除的正常皮膚組織標(biāo)本18例。
　　2.采用熒光定量RT-PCR方法檢測miR-21在18例CSCC和18例正常皮膚組織中的表達(dá)水平。
　　3.采用Westernblot和免疫組織化學(xué)方法檢測18例CSCC組織和1

15、8例正常皮膚組織中PDCD4和PTEN的表達(dá)情況。
　　4.分析miR-21的表達(dá)和CSCC的臨床分期及組織分化程度的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.CSCC組織中miR-21表達(dá)高于正常皮膚組織，兩種組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.644，P＜0.001）。MiR-21表達(dá)與CSCC的發(fā)病年齡、性別的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與腫瘤分期及病理分級的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.West

16、ernblot方法檢測CSCC組織中PDCD4的灰度相對定量值為0.692±0.072，比正常皮膚組織中PDCD4的灰度相對定量值1.018±0.045低（t=-11.522，P＜0.05）。免疫組織化學(xué)方法檢測正常皮膚組織中PDCD4蛋白呈高表達(dá)，陽性染色定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核;CSCC組織中PDCD4蛋白呈低表達(dá)或不表達(dá)，陽性染色主要定位于細(xì)胞漿。CSCC組織PDCD4蛋白表達(dá)低于正常皮膚組織，兩種組織表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3

17、.573，P＜0.001)。
　　3.Westernblot方法檢測CSCC組織中PTEN的灰度相對定量值為0.493±0.141，比正常皮膚組織中PTEN的灰度相對定量值0.977±0.029低(t=-10.047，P＜0.05)。免疫組織化學(xué)方法檢測正常皮膚組織中PTEN蛋白呈高表達(dá)，陽性染色定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核;CSCC組織PTEN蛋白呈低表達(dá)或不表達(dá)，陽性染色主要定位于細(xì)胞漿。CSCC組織PTEN蛋白表達(dá)低于正常皮膚組織，

18、兩種組織表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.237，P＜0.05)。
　　小結(jié)：
　　1.miR-21在CSCC組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤分期及病理分級的差異有關(guān)。
　　2.miR-21的靶基因PDCD4及PTEN蛋白在CSCC組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，陽性染色主要定位于細(xì)胞漿。
　　第二部分反義抑制miR-21對其靶基因PDCD4和PTEN蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡在皮膚鱗癌A431細(xì)胞株中的影響
　　目的：<

19、br>　　探討反義抑制miR-21對其靶基因PDCD4和PTEN在CSCCA431細(xì)胞株中表達(dá)的影響及對細(xì)胞凋亡的影響，探討miR-21對CSCC發(fā)病機(jī)制的作用及反義抑制miR-21在CSCC治療中的意義。
　　方法：
　　1.A431細(xì)胞分為Cell組:未轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞;NC組:轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的A431細(xì)胞;AS-ODN組:轉(zhuǎn)染miR-21AS-ODNA431細(xì)胞。
　　2.采用熒光定量RT-PCR檢測miR-21

20、在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　3.采用Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測各組細(xì)胞中PDCD4和PTEN的表達(dá)情況。
　　4.采用TUNEL檢測轉(zhuǎn)染前后A431細(xì)胞株中細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后皮膚鱗癌細(xì)胞株A431中miR-21表達(dá)下降，Cell組為1.00±0.06、NC組為0.98±0.77、AS-ODN組為0.42±0.01，三組表達(dá)有差異(F=107.24，P＜

21、0.05)，Cell組和NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Cell組和AS-ODN組、NC組和AS-ODN組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細(xì)胞株中PDCD4和PTEN的表達(dá)增強(qiáng)。Westernblot檢測三組細(xì)胞中PDCD4表達(dá)的灰度相對定量值Cell組為1.021±0.035、NC組為0.979±0.061，AS-ODN組為1.827±0.023，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=

22、119.13，P＜0.05)，轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細(xì)胞中PDCD4表達(dá)增加。三組細(xì)胞中PTEN表達(dá)表達(dá)的灰度相對定量值Cell組為1.014±0.052、NC組為0.985±0.027，AS-ODN組為2.554±0.034，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=249.64，P＜0.05)，轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細(xì)胞中PTEN表達(dá)增加。
　　3.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測PDCD4在細(xì)胞核以及細(xì)胞漿均有表達(dá)，cell組以及NC組

23、染棕褐色，均少量表達(dá)，AS-ODN組染棕褐色，強(qiáng)表達(dá)。PTEN在細(xì)胞核以及細(xì)胞漿均有表達(dá)，cell組以及NC組染棕黃色，均少量表達(dá)，AS-ODN組染棕褐色，強(qiáng)表達(dá)。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細(xì)胞株中PDCD4和PTEN的表達(dá)增強(qiáng)。免疫細(xì)胞化學(xué)法PDCD4表達(dá)Cell組為62340.03±2157.52、NC組為55871.36±7281.27，AS-ODN組為175302.34±14571.90，三組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)

24、學(xué)意義(F=50.12，P＜0.05)，Cell組和NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Cell組和AS-ODN組、NC組和AS-ODN組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PTEN表達(dá)Cell組為19206.26±655.01、NC組為19149.26±1058.29，AS-ODN組為135572.92±4685.05，三組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=576.54，P＜0.05)，Cell組和NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0

25、.05），Cell組和AS-ODN組、NC組和AS-ODN組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后A431細(xì)胞株中細(xì)胞凋亡率較Cell組和NC組增加（圖3），細(xì)胞凋亡率Cell組為0.10±0.02、NC組為0.13±0.01，AS-ODN組為0.36±0.03，三組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=201.79，P＜0.05)，Cell組和NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Cell組和AS-O

26、DN組、NC組和AS-ODN組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　小結(jié)：
　　1.轉(zhuǎn)染Anti-miR-21后A431細(xì)胞株中miR-21表達(dá)下降，表明miR-21AS-ODN可成功抑制A431細(xì)胞株中miR-21的表達(dá)。
　　2.反義抑制miR-21后A431細(xì)胞株中PDCD4的表達(dá)比反義抑制前增高，反義抑制miR-21后A431細(xì)胞株中PTEN的表達(dá)比反義抑制前增高。
　　3.反義抑制miR-21后A

27、431細(xì)胞株中凋亡細(xì)胞比例比反義抑制前增高。
　　結(jié)論：
　　1.miR-21在CSCC組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)和腫瘤的臨床分期及分化程度相關(guān)。
　　2.miR-21靶基因PDCD4P和TEN蛋白在CSCC組織中呈低表達(dá)，陽性染色主要定位于細(xì)胞漿。
　　3.轉(zhuǎn)染Anti-miR-21后A431細(xì)胞株中miR-21表達(dá)下降，成功構(gòu)建抑制miR-21的A431細(xì)胞株。
　　4.反義抑制miR-21可以上調(diào)A431