響應(yīng)椪柑原生質(zhì)體分離過程中microRNA及其靶基因的鑒定和表達研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是生物體內(nèi)普遍存在的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA結(jié)合介導其降解或翻譯抑制，參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達調(diào)控，在植物生長發(fā)育、新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導以及逆境脅迫響應(yīng)中起著重要的作用。植物原生質(zhì)體分離是一個逆境過程，胞內(nèi)的應(yīng)激響應(yīng)則直接影響到原生質(zhì)體的再生表現(xiàn)。為研究miRNA在柑橘原生質(zhì)體分離中的可能作用，本研究以椪柑愈傷組織和其原生質(zhì)體為研究對象，提取總RNA構(gòu)建2個小RNA文庫;通過HiSeq高通量

2、測序與生物信息學分析進行miRNA鑒定、靶基因預測及其功能初步預測;利用poly(A)-Tailed qPCR方法對8個表達具顯著差異性的miRNA進行驗證;采用RT-PCR對8個的候選靶基因進行表達分析。主要結(jié)果如下:
　　1.椪柑原生質(zhì)體總RNA提取方法的篩選
　　采用Trizol法、改良Trizol法、改良CTAB法和TaKaRa RNA提取試劑盒四種方法提取椪柑原生質(zhì)體的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計和

3、RT-PCR檢測其質(zhì)量和產(chǎn)量。結(jié)果表明改良Trizol法提取的總RNA完整性好，OD260/OD280和OD260/OD230測定值都在正常范圍內(nèi)，且總RNA產(chǎn)量最高，另外RT-PCR驗證表明，以改良Trizol法提取的RNA為模板所擴增出的目的條帶最清晰明亮，且與目的片段大小一致。因此，改良Trizol法可用于椪柑原生質(zhì)體高質(zhì)量總RNA的提取。
　　2.小RNA文庫高通量測序數(shù)據(jù)分析
　　(1)在椪柑愈傷組織與原生質(zhì)體小R

4、NA文庫中，分別獲得17975734與15828591條原始小RNA序列，其中高質(zhì)量序列分別占原始小RNA序列的99.83％和99.73％，說明構(gòu)建的文庫質(zhì)量完全符合要求。通過去接頭、去低質(zhì)量reads和去污染等初級處理分析處理得clean sRNA序列，分別為17899040與15663034條，占高質(zhì)量序列的99.74％和99.22％。
　　(2)在愈傷組織和原生質(zhì)體的小RNA文庫中，分別鑒定出61個和60個已知的miRNA，

5、預測到492和477個候選靶基因;分別鑒定出265個和229個新的miRNA，預測到1167和1130個候選靶基因;另外，還檢測到4個miRNA*。
　　(3)通過對兩文庫中miRNA的表達進行顯著性差異分析，共得到18個表達具顯著差異已知miRNA。其中11個在原生質(zhì)體中上調(diào)表達，7個下調(diào)表達;共獲得64個表達具顯著差異的新miRNA，其中29個在原生質(zhì)體中上調(diào)表達，35個下調(diào)表達。
　　(4)通過甜橙基因組信息（http

6、://citrus.hzau.edu.cn/orange/），將預測的miRNA靶基因進行功能注釋，發(fā)現(xiàn)這些預測的靶基因涉及到多個轉(zhuǎn)錄因子和功能蛋白。
　　3.miRNA的表達驗證
　　選取8個表達具顯著差異的miRNAs（crt-miR171，csi-miR319，csi-miR172a*，csi-miR535,novel-mir-187,novel-mir-235,novel-mir-172和novel-mir-98）進

7、行poly(A)-Tailed qPCR驗證。結(jié)果表明，2個上調(diào)表達，6個下調(diào)表達，與高通量測序結(jié)果一致。
　　4.靶基因RT-PCR分析
　　為了分析miRNA與其靶基因之間的表達模式，選取熒光定量PCR已驗證的8個miRNA所對應(yīng)的靶基因進行RT-PCR分析。結(jié)果表明，愈傷組織與原生質(zhì)體的靶基因表達變化與miRNA表達變化相反，暗示這些miRNA對其靶基因起負調(diào)控作用。
　　本研究為初步揭示miRNA參與調(diào)控柑橘原