長白山人參microRNA鑒定及靶基因分析研究.pdf

1、目的:以15年生石柱參、6年生園參為研究對象，運(yùn)用高通量測序技術(shù)構(gòu)建人參small RNA、轉(zhuǎn)錄組及降解組數(shù)據(jù)庫。鑒定兩種人參中所含miRNA的種類，篩選差異表達(dá)miRNA，并進(jìn)行靶基因預(yù)測、驗(yàn)證及分析。
　　方法：
　　1、選用Trizol法抽提園參、石柱參總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、TGem微量分光光度計(jì)、Agilent2100 Bioanalyzer檢測總RNA的質(zhì)量、純度及完整性。
　　2、利用Illumina

2、 HiSeqTM2000測序儀進(jìn)行園參、石柱參轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)短序列組裝拼接獲得兩樣本的Non-All-Unigene，將其與Nr、KOG、KEGG、GO等數(shù)據(jù)庫比對分析，得到Unigene的蛋白功能注釋及代謝通路信息。篩選樣本間差異表達(dá)mRNA，進(jìn)行GO、KEGG富集分析，利用Q-PCR對差異mRNA進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3、構(gòu)建園參、石柱參small RNA文庫，以Unigene為參考基因組序列。將獲得的Clean reads與Rfa

3、m、Gene、Repbase及miRBase21.0數(shù)據(jù)庫比對，得到已知miRNA并統(tǒng)計(jì)其表達(dá)量；未比對上的序列用于新miRNA的預(yù)測。篩選樣本間差異miRNA，進(jìn)行靶基因預(yù)測及KEGG、GO富集分析，采用Q-PCR對差異miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4、構(gòu)建兩樣本降解組數(shù)據(jù)庫，獲得原始序列與Rfam、Genbank、PolyN等數(shù)據(jù)庫比對，得到cDNA-sense。cDNA-sense與Unigene、已知miRNA進(jìn)行miRNA降

4、解位點(diǎn)的鑒定與分析后，再與Nr、KEGG和GO數(shù)據(jù)庫比對，獲得降解基因的功能注釋信息。
　　結(jié)果：
　　1、瓊脂糖凝膠電泳顯示，兩樣本總RNA的28S、18S條帶清晰完整，亮度接近2倍；Agilent2100 Bioanalyzer質(zhì)檢可見OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.1范圍，OD260nm/OD280nm比值在2.0～2.3，RIN＞7.0，RNA濃度>900ng/μL，28S/18S＞1.0，即總RNA

5、質(zhì)量滿足高通量建庫的標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、兩樣本轉(zhuǎn)錄組測序獲得5千多萬條reads，經(jīng)De Novo拼接獲得63875條去冗余Unigene。對Unigene進(jìn)行功能注釋，有19340條Unigene被歸類到25個組蛋白直系KOG類別，20778條Unigene被歸類為64個GO功能類別，7268條Unigene被歸類到207個KEGG Pathway代謝通路。根據(jù)基因表達(dá)差異倍數(shù)FoldChange及P-value篩選出3216條差異

6、mRNA，并選取差異顯著的18條基因進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量基本一致。
　　3、通過small RNA高通量測序，在石柱參中鑒定235種已知miRNA，園參有246種已知miRNA，分屬于71個miRNA家族；未被任何數(shù)據(jù)庫比對上的序列進(jìn)行新miRNA的預(yù)測，得到39個新miRNA。對已知和新miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，得到17個miRNA家族的169個靶基因，對這些靶基因進(jìn)行富集分析，按其功能注釋主要包括：蛋白轉(zhuǎn)

7、錄因子、編碼與植物生長發(fā)育有關(guān)的蛋白、生長素響應(yīng)因子、泛素連接酶及非特征性蛋白等。根據(jù)miRNA表達(dá)差異倍數(shù)及P值，選取13條差異miRNA進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與miRNA表達(dá)量基本一致。
　　4、通過構(gòu)建降解組文庫及與數(shù)據(jù)庫比對分析，在石柱參和園參中分別得到1千余萬條cDNA-sense，用以降解位點(diǎn)的鑒定。根據(jù)cleaveland峰值，石柱參、園參中分別檢測到812個、724個剪切位點(diǎn)。結(jié)合生物信息學(xué)miRNA靶基因預(yù)

8、測方法，對cDNA-sense的降解位點(diǎn)進(jìn)行注釋，共得到8個miRNA家族的13個靶基因，其中兩個屬于新miRNA的靶基因。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建人參轉(zhuǎn)錄基因組、small RNA及降解組文庫，鑒定石柱參、園參所含microRNA的種類，證實(shí)新鮮人參中富含microRNA。
　　2、不同生長年限人參miRNA存在差異表達(dá)，顯著差異miRNA主要調(diào)控DCL、E2-UBC、ACA8、AP2等靶基因的調(diào)節(jié)。