朵麗蝶蘭microRNA172干涉載體構(gòu)建及其靶基因克隆.pdf

1、朵麗蝶蘭(Doritaenopsis hybrid)作為蝴蝶蘭（Phalaenopsis）與朵麗蘭(Doritis)的雜交品種，是目前市場上應(yīng)用最多的商品蝴蝶蘭雜交品種之一。它以花期長，花形優(yōu)雅，色彩艷麗等特點(diǎn)深受人們喜愛。但是其開花需要經(jīng)歷一段18-25℃的相對低溫誘導(dǎo)，所以溫度成為制約其開花上市的主要原因之一。探究溫度調(diào)控朵麗蝶蘭開花時間的分子機(jī)制，是克服溫敏現(xiàn)象的關(guān)鍵科學(xué)問題。本研究以朵麗蝶蘭為材料，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建Dh

2、MIR172干涉載體，為后續(xù)朵麗蝶蘭的遺傳轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備。利用RACE技術(shù)克隆DhMIR172候選靶基因DhAP2-1、DhAP2-2、DhAP2-3。為進(jìn)一步明確DhMIR172及其靶基因在朵麗蝶蘭低溫成花過程中的重要作用與調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)論如下:
　　1、DhMIR172的RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建
　　根據(jù)RNA干擾原理，利用本實(shí)驗(yàn)室已克隆的DhMIR172序列設(shè)計(jì)Gateway引物，PCR擴(kuò)增后引入定向連接位點(diǎn)

3、。通過pENTRTM Directional TOPO(@)Cloning Kits試劑盒構(gòu)建入門載體，再將目的序列定向轉(zhuǎn)移至表達(dá)載體pHELLAGATE8，構(gòu)建DhMIR172基因RNA干擾表達(dá)載體pHELLAGATE8-DhMIR172。
　　以朵麗蝶蘭0908原球莖為外植體，用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，以300mg/L的羧芐青霉素抑制農(nóng)桿菌生長，壯觀霉素抗性培養(yǎng)基篩選再生苗，驗(yàn)證所構(gòu)建的RNA干涉載體的表達(dá)效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

4、恢復(fù)培養(yǎng)一星期后，農(nóng)桿菌爆發(fā)，原球莖開始褐化;恢復(fù)培養(yǎng)兩星期后，原球莖全部褐化死亡。未得到轉(zhuǎn)基因植株。
　　2、靶基因DhAP2-1、DhAP2-2、DhAP2-3全長克隆
　　從小蘭嶼蝴蝶蘭數(shù)據(jù)庫中BLAST得到三個DhMIR172候選靶基因(DhAP2-1、DhAP2-2和DhAP2-3)，以朵麗蝶蘭cDNA為模板分別克隆靶基因全長。本實(shí)驗(yàn)室已克隆得到DhAP2-1中間片段，分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行3'RACE和5'RACE全長

5、克隆，選取5'端片段，3'端片段以及中間片段進(jìn)行基因全長拼接，得到2220bp的朵麗蝶蘭DhMIR172靶基因DhAP2-1全長cDNA，含有一個1479bp的ORF區(qū)，編碼492個氨基酸，含有兩個AP2保守結(jié)構(gòu)域和DhMIR172結(jié)合位點(diǎn)。利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增靶基因DhAP2-2和DhAP2-3，DhAP2-2cDNA全長1038bp，含有一個1038bp的ORF區(qū)，編碼345個氨基酸，含有兩個AP2保守結(jié)構(gòu)域。DhAP2-3cDN

6、A全長738bp，含有一個738bp的ORF區(qū)，編碼245個氨基酸，含有一個AP2保守結(jié)構(gòu)域。
　　3、雙熒光素酶檢測DhMIR172與候選靶基因的互作關(guān)系。
　　本實(shí)驗(yàn)主要檢測共轉(zhuǎn)野生型克隆AP2-WT過表達(dá)載體和miR172mimic，共轉(zhuǎn)突變型克隆AP2-MUTA過表達(dá)載體和miR172mimic到293T細(xì)胞后，檢測熒光素酶活性。同時以共轉(zhuǎn)野生型克隆AP2-WT過表達(dá)載體和NC mimic，共轉(zhuǎn)突變型克隆AP2-MU