EcoTILLING技術(shù)體系的建立及其在棉花優(yōu)異復(fù)等位基因發(fā)掘中的初探.pdf

1、TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes，定向誘導(dǎo)基因組局部突變)技術(shù)由美國西雅圖的Fred Hutchinson癌癥研究中心Steven Henikoff和華盛頓大學(xué)植物學(xué)系Luca Comai為首的科學(xué)家發(fā)展建立起來的，它將高頻率誘導(dǎo)點(diǎn)突變、PCR篩選與高通量檢測(cè)有效結(jié)合，以發(fā)現(xiàn)和分析目標(biāo)區(qū)域的點(diǎn)突變，是一種全新的高通量、低成本的反向遺傳學(xué)研究方法。隨后的研究也表明這一技術(shù)

2、不但可以有效檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變，而且也可以檢測(cè)群體中自然存在的基因多態(tài)性，并將該技術(shù)定義為EcoTILLING。棉花是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物。為了發(fā)掘和利用棉花種質(zhì)資源中廣泛存在的優(yōu)異等位基因?yàn)槊藁ǚ肿釉O(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)，本文開展了棉花EcoTILLING技術(shù)體系技術(shù)的創(chuàng)建，并利用所建立的棉花EcoTILLING技術(shù)體系，對(duì)棉花GhSus1和Gh14-3-3L兩個(gè)纖維發(fā)育相關(guān)的候選基因開展棉花優(yōu)異復(fù)等位基因的發(fā)掘研究。結(jié)果如下:
　　

3、 采用鹽析法從西芹(Apium graveloens L)中提取核酸內(nèi)切酶CELⅠ，經(jīng)分子量檢測(cè)、酶活性檢測(cè)（SURVEYOR Mutation Detection Kit Components自帶的Control C和Control G異質(zhì)雙鏈），結(jié)果表明，分子量與已報(bào)道的43KD相同，其酶切效果與SURVEYOR Nuclease（購自基因環(huán)球公司）相同，可用于EcoTILLING研究中異質(zhì)雙鏈的酶切。
　　 考慮到四倍體栽

4、培棉為異源四倍體，為了避免A和D染色體亞組部分同源基因之間多態(tài)性干擾，必需對(duì)GhSus1和Gh14-3-3L兩個(gè)纖維發(fā)育相關(guān)基因設(shè)計(jì)棉花At/Dt亞組基因特異性引物。針對(duì)這兩個(gè)纖維發(fā)育相關(guān)候選基因的基因組序列，共設(shè)計(jì)出50對(duì)引物，經(jīng)試驗(yàn)篩選檢測(cè)出16對(duì)引物可用于EcoTILLING研究。
　　 利用這兩個(gè)候選基因的At/Dt亞組基因特異性引物，以TM1和棉花種質(zhì)資源樣品的DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將前者的擴(kuò)增產(chǎn)物分別與后者

5、的擴(kuò)增產(chǎn)物各取10μL等量混合，變性復(fù)性后，取8μL與1μL緩沖液和1μL芹菜汁提取物(celery juiceextract, CJE)充分混勻，在42℃水浴鍋中酶切40 min，酶切產(chǎn)物通過PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果存在SNP位點(diǎn)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物形成的異質(zhì)雙鏈能被CJE酶切，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果兩者完全一致，表明:創(chuàng)建的棉花EcoTILLING技術(shù)體系穩(wěn)定、可靠，可用于棉花基因多態(tài)性研究。
　　 利用建立的EcoTILLING技術(shù)體系，

6、對(duì)320份棉花種質(zhì)資源的兩個(gè)纖維發(fā)育相關(guān)的候選基因開展基因多態(tài)性研究。結(jié)果表明，在GhSus1的At亞組中存在S3-S6這4個(gè)SNP，9種基因型;在Dt亞組中存在S7-S10這4個(gè)SNP，6種基因型。在Gh14-3-3L的At亞組中存在S1這1個(gè)SNP，2種基因型;在Dt亞組中存在S2這1個(gè)SNP，2種基因型。
　　 利用SPSS Statistics17.0軟件對(duì)基因多態(tài)性與纖維品質(zhì)進(jìn)行單標(biāo)記分析。結(jié)果表明:GhSus1與棉花

7、纖維品質(zhì)密切相關(guān)，其At亞組中基因型為3、7、8的種質(zhì)資源纖維長(zhǎng)度、強(qiáng)度、馬克隆值和整齊度等較好，而基因型為1、2、4的種質(zhì)資源則較低，基因型為3、7的種質(zhì)資源，衣分和單鈴重較高;Dt亞組中基因型為4的種質(zhì)資源在上述六種性狀中均較好。Gh14-3-3L的At亞組基因型為1的種質(zhì)資源纖維品質(zhì)優(yōu)于2;Dt亞組中兩種基因型之間無明顯差異。
　　 利用STRUCTRE軟件和TASSEL軟件對(duì)上述10個(gè)SNP與纖維品質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表