經(jīng)典HLAⅠ類等位基因特異性定量PCR方法的建立及肝癌細(xì)胞選擇性調(diào)節(jié)HLA-A等位基因表達(dá)的初步研究.pdf

1、HLA(human leukocyte antigen)系統(tǒng)是迄今所知人類多態(tài)性最為豐富的遺傳系統(tǒng)。其中經(jīng)典HLAI類基因包括HLA-A，-B，-C，是基因多態(tài)性最高的區(qū)域，其編碼的經(jīng)典HLAI類分子普遍表達(dá)于有核細(xì)胞表面。
　　 CTL和NK細(xì)胞是腫瘤免疫中最重要的兩類效應(yīng)細(xì)胞，其發(fā)揮免疫效應(yīng)均需要經(jīng)典HLAI類分子介導(dǎo)。一方面，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面HLA-肽復(fù)合體，啟動(dòng)免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞（T細(xì)胞的MH

2、C限制性）。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞存在經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)下調(diào)或缺失，以逃避CTL免疫殺傷。另一方面，NK細(xì)胞表面抑制性KIR分子識(shí)別經(jīng)典HLAI類分子，抑制NK細(xì)胞活性。一旦腫瘤細(xì)胞表面經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)下調(diào)或丟失，NK細(xì)胞被活化，發(fā)揮免疫殺傷效應(yīng)（“missing-self”理論）。
　　 因此，腫瘤細(xì)胞要逃避CTL殺傷，需要下調(diào)經(jīng)典HLAI類分子表達(dá);而要逃避NK細(xì)胞的殺傷，則要上調(diào)經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)。那么，腫瘤細(xì)胞

3、是如何調(diào)節(jié)其表面經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)，同時(shí)逃避CTL和NK細(xì)胞的雙重殺傷？
　　 肝臟中，NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的30％。高于外周血中5～10％。因此肝臟腫瘤細(xì)胞要應(yīng)對(duì)更多來(lái)自CTL和NK細(xì)胞的雙重選擇壓力。鑒于此，我們以原發(fā)性肝細(xì)胞癌為研究對(duì)象，探討肝癌細(xì)胞是否存在一種選擇性調(diào)節(jié)經(jīng)典HLAⅠ類分子表達(dá)的免疫逃避機(jī)制？即上調(diào)或者維持NK細(xì)胞抑制性KIR受體所對(duì)應(yīng)配體經(jīng)典HLAI類分子的表達(dá)，抑制NK細(xì)胞活性，而同時(shí)下調(diào)其他經(jīng)典

4、HLAⅠ類分子的表達(dá)，減少抗原遞呈逃避CTL殺傷？
　　 我們首先設(shè)計(jì)經(jīng)典HLAⅠ類等位基因特異性定量PCR引物，以南京地區(qū)肝癌患者為研究對(duì)象，進(jìn)行KIR和經(jīng)典HLAⅠ類基因分型。根據(jù)經(jīng)典HLAⅠ類基因分型結(jié)果選擇對(duì)應(yīng)的定量PCR引物，從mRNA水平分析同一個(gè)體肝癌組織相對(duì)其癌旁組織經(jīng)典HLAⅠ類等位基因表達(dá)水平的變化，并結(jié)合KIR基因分型結(jié)果組合分析，初步探討肝癌細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。研究結(jié)果如下:
　　 (1)通過(guò)PC

5、R-SBT方法，分別完成HLA-A，-B，-C基因分型46、47、39例，其中包括6例細(xì)胞系(HepG2、NK92、THP-1、KB、BR、293T)作為陽(yáng)參。PCR-SSP方法完成38例肝癌標(biāo)本KIR基因分型。
　　 (2)完成經(jīng)典HLAⅠ類等位基因特異性定量PCR引物的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，最終得到7對(duì)HLA-A引物，覆蓋全部HLA-A等位基因;7對(duì)HLA-B引物，覆蓋人群中分布頻率大于3％的所有HLA-B等位基因。
　　 (

6、3)完成32例肝癌患者（癌和癌旁組織）128條HLA-A等位基因mRNA表達(dá)水平的定量分析，癌組織相比其癌旁統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，HLA-A等位基因上調(diào)表達(dá)占34％，表達(dá)一致為39％，下調(diào)表達(dá)為27％。
　　 (4)結(jié)合KIR基因型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在KIR基因型為AA的個(gè)體中，肝癌相對(duì)癌旁HLA-A表達(dá)下調(diào)的比例為47％，高于基因型為BX個(gè)體中的19％，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)。同時(shí)，KIR-AA基因型個(gè)體HLA-A11表達(dá)下調(diào)比例為67％

7、，而KIR-BX為0，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)。
　　 綜上所述，我們?cè)O(shè)計(jì)完成經(jīng)典HLAⅠ類等位基因特異性定量PCR引物，解決經(jīng)典HLAⅠ類等位基因mRNA水平定量分析的關(guān)鍵問(wèn)題。32例肝癌及癌旁組織HLA-A等位基因定量分析，結(jié)合KIR基因型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，AA基因型個(gè)體相比BX基因型，HLA-A更傾向于下調(diào)，其中HLA-A11下調(diào)，可能有助于肝癌逃避NK和CTL的雙重殺傷。
　　 HLA基因的高度多態(tài)性，導(dǎo)致每一等位基