CRISPR-Cas9高效等位基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建及其在豬基因組編輯中的應(yīng)用研究.pdf

1、基因組編輯是借助于細(xì)胞自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制對(duì)目標(biāo)基因序列進(jìn)行堿基刪除、插入或突變的基因組操作過(guò)程。早期僅依靠自發(fā)性同源重組的基因組編輯效率極低，直到人工核酸酶出現(xiàn)，由人工核酸酶定點(diǎn)切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，激活體內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制進(jìn)行定點(diǎn)的基因組編輯，極大的提高了編輯的效率。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，一些基因得到注釋?zhuān)蚬δ艿难芯砍蔀橹攸c(diǎn)和熱點(diǎn)，目前研究基因功能的手段主要是基因修飾技術(shù)。近年來(lái)，CRISPR/Cas9核酸酶以其簡(jiǎn)單、快捷

2、、高效的特點(diǎn)迅速發(fā)展，廣泛運(yùn)用于不同種類(lèi)細(xì)胞的基因組修飾。精準(zhǔn)的定點(diǎn)基因組編輯技術(shù)不僅能推進(jìn)基因功能的研究，用于構(gòu)建人類(lèi)疾病模型、基因治療，還能加快動(dòng)物的遺傳改良。
　　雙等位基因基因組修飾細(xì)胞的獲得費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且效率很低，目前這仍然是基因組編輯技術(shù)中的一個(gè)難點(diǎn)。本研究開(kāi)發(fā)了一套CRISPR/Cas9高效等位基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)有效整合了基因編輯陽(yáng)性細(xì)胞富集報(bào)告系統(tǒng)（Surrogate Reporter,Rep）與含有sgRNA的供

3、體系統(tǒng)(Donor,Don)。其特點(diǎn)是既能作為供體提供修復(fù)的模板，又能作為報(bào)告系統(tǒng)反應(yīng)核酸酶的活性和靶位點(diǎn)整合的效率。首先在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)該系統(tǒng)(Rep/Don)進(jìn)行了概念驗(yàn)證，結(jié)果顯示雙等位基因位點(diǎn)的基因敲入效率得到了顯著提高。隨后用Rep/Don打靶系統(tǒng)在豬PK15細(xì)胞上對(duì)lnc-sscg3623基因進(jìn)行了基因編輯研究，同樣獲得了高效雙等位基因位點(diǎn)的編輯結(jié)果。
　　1.構(gòu)建用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組編輯的三個(gè)整合系統(tǒng)Rep/Do

4、n PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR。其中Rep/Don PG系統(tǒng)中包含一個(gè)抗性基因(puror)和一個(gè)熒光蛋白基因(eGFP)，兩個(gè)基因通過(guò)剪切肽(T2A)連接（Puror-eGFP）。與前述整合系統(tǒng)類(lèi)似，Rep/DonNR和Rep/Don ZR系統(tǒng)中分別含有Neor-mRFP和Zeor-mRFP元件。三個(gè)整合系統(tǒng)中每個(gè)抗性基因編碼區(qū)分別插入了CRISPR/Cas9的靶位點(diǎn)序列，該靶位點(diǎn)序列的兩端含有200bp的抗性基

5、因重復(fù)片段，從而構(gòu)成了SSA(Single Strand Annealing)結(jié)構(gòu)，當(dāng)CRISPR/Cas9核酸酶對(duì)靶序列進(jìn)行切割后，產(chǎn)生載體DNA的雙鏈斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)機(jī)制的激活。從而對(duì)載體進(jìn)行SSA介導(dǎo)的損傷修復(fù)，修復(fù)的結(jié)果導(dǎo)致抗性基因的閱讀框恢復(fù)正常表達(dá)。除了對(duì)整合系統(tǒng)中的報(bào)告基因進(jìn)行靶向切割外，CRISPR/Cas9同時(shí)對(duì)細(xì)胞基因組上的靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，由于整合載體中含有基因組上靶位點(diǎn)的同源序列，細(xì)胞對(duì)基因組DNA的

6、損傷將會(huì)通過(guò)同源重組(Homologous Directed Repair,HDR)修復(fù)機(jī)制以載體為模板進(jìn)行修復(fù)，通過(guò)對(duì)修復(fù)后的抗性基因篩選，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因組編輯后的陽(yáng)性細(xì)胞富集。由于兩個(gè)等位基因位點(diǎn)上整合了含有不同抗性基因的供體，因此同時(shí)對(duì)兩個(gè)抗性基因的篩選能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)雙等位基因位點(diǎn)編輯細(xì)胞的富集。
　　2.將構(gòu)建的Rep/Don PG和Rep/Don ZR打靶系統(tǒng)在HEK293T細(xì)胞上對(duì)目標(biāo)基因CCR5進(jìn)行了編輯，結(jié)果表明，Re

7、p/Don PG和Rep/Don ZR單系統(tǒng)的雙敲效率分別是2.33％和2.08％，Rep/Don PG+ZR的雙敲效率為34.09％。
　　3.通過(guò)藥物殺傷實(shí)驗(yàn)確定嘌呤霉素（Puromycin）、G418和博萊霉素(Zeocin)這三種抗生素藥物在豬PK15細(xì)胞中的最佳工作濃度。嘌呤霉素的最佳篩選濃度是1μg/mL，G418是1200μg/mL，博萊霉素為400μg/mL。
　　4.設(shè)計(jì)三條豬lncRNA基因lnc-ssc

8、g3623的sgRNA，構(gòu)建了相應(yīng)的CRISPR/Cas9表達(dá)載體和RPG報(bào)告載體，共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后通過(guò)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)，初步判別sgRNA的效率，選擇了活性較高的sgRNA Tar2和sgRNA Tar1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　5.構(gòu)建了用于編輯豬lnc-sscg3623基因兩個(gè)靶位點(diǎn)Tar2和Tar1的Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR打靶系統(tǒng)及對(duì)應(yīng)的CRISPR/Cas9打靶載體

9、。在lnc-sscg3623基因Tar1位點(diǎn)，Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR單個(gè)打靶系統(tǒng)在豬PK15細(xì)胞系中的單敲效率分別為:25％、37.5％和26.32％。Rep/Don PG+ZR的雙敲效率為:10％。在Tar2位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)各打靶系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的抗生素（嘌呤霉素、G418和博萊霉素）篩選后，得到敲入的陽(yáng)性細(xì)胞，三個(gè)單系統(tǒng)Rep/Don PG、Rep/Don NR、Rep/Don ZR的單敲效率分別為:75