甘藍(lán)花粉管鈣感受蛋白編碼基因CML49的克隆及功能鑒定研究.pdf

1、花粉萌發(fā)(Pollen Germination，PG)及花粉管伸長(zhǎng)(Pollen Tube Growth，PTG)是開花植物有性生殖的重要階段。Ca2+信號(hào)系統(tǒng)與激素在植物的花發(fā)育（成花誘導(dǎo)、花芽分化和開花調(diào)控）、有性生殖（研究主要集中在花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)）、逆境生理等方面都起著非常重要的作用。目前對(duì)Ca2+相關(guān)的信號(hào)傳遞機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)有Ca2+/CaM[包括類CaM蛋白(CMLs)]、Ca2+/CDPK和Ca2+/CBL三類鈣信號(hào)

2、系統(tǒng)。他們都含有不同個(gè)數(shù)的EF-hands結(jié)構(gòu)域，EF-hands具有高親和力以結(jié)合Ca2+。植物體中除了保守的CaMs家族，還有CMLs家族，在鈣信號(hào)傳導(dǎo)中也可能具重要作用。對(duì)擬南芥基因組的研究發(fā)現(xiàn)，其基因組含有7個(gè)CaMs和50個(gè)CMLs，其中5個(gè)CaMs和19個(gè)CMLs是在PG和PTG試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，這些基因中有4個(gè)基因(CML39、CML49、CML3和CML16)在PG過程中上調(diào)表達(dá)，CML49也在PTG中轉(zhuǎn)錄水平增加。植物物種

3、中每類鈣信號(hào)系統(tǒng)均為家族蛋白，大部分鈣結(jié)合蛋白生理作用還未清楚，因此對(duì)鈣信號(hào)系統(tǒng)家族成員功能的研究可能成為研究植物生長(zhǎng)發(fā)育過程的熱點(diǎn)內(nèi)容。
　　本試驗(yàn)以自交不親和材料E1和F1為材料，通過雙向電泳篩選得到鈣感受蛋白CML49，通過同源克隆及RACE技術(shù)從花粉中克隆了CML49基因，從柱頭中克隆得到SRK7基因。構(gòu)建了CML49及其及突變體、SRK7及其截短體的原核表達(dá)載體和酵母雙雜交重組表達(dá)載體，并通過β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)相互作

4、用強(qiáng)度，篩選與鑒定CML49與SRK7相互作用及其蛋白互作的結(jié)構(gòu)域。從番茄中擴(kuò)增得到花粉特異性啟動(dòng)子LAT52，構(gòu)建了LAT52啟動(dòng)下的CML49反義表達(dá)載體，對(duì)甘藍(lán)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而驗(yàn)證CML49基因的生物學(xué)功能。本研究希望能為CML49基因在花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的研究，及研究鈣調(diào)蛋白CML49在自交不親和過程的作用提供參考。
　　主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.雙向電泳篩選、確定鈣感應(yīng)蛋白CML49
　　以結(jié)球甘藍(lán)E1、F

5、1為材料，提取花粉萌發(fā)前和萌發(fā)后的混合花粉總蛋白，總蛋白雙向電泳后通過MALDI-TOF-MS鑒定分析差異點(diǎn)，質(zhì)譜分析得到花粉萌發(fā)中表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)CML49。
　　2.結(jié)球甘藍(lán)CML49基因的克隆及分析
　　通過同源擴(kuò)增及RACE擴(kuò)增得到了CML49基因的全長(zhǎng)序列1343 bp，開放閱讀框954 bp，編碼317個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量大小為33.51 kD，pI為6.93。經(jīng)Smart-embl預(yù)測(cè)其含2個(gè)重要的EF-h

6、and結(jié)構(gòu)域;與擬南芥AtCML49和AtCML50的親緣關(guān)系較近;CML49基因的不同器官的表達(dá)分析表明該基因在不同器官均有表達(dá)，且在莖中的表達(dá)量最高，在花粉中也有較高的表達(dá)量;CML49基因的qPCR分析表明其表達(dá)量在花粉萌發(fā)前約為萌發(fā)后的2.73倍，表明CML49基因在花粉萌發(fā)后表達(dá)下調(diào)。
　　3.甘藍(lán)CML49與SRK7相互作用檢測(cè)
　　以F1材料柱頭總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增得到SRK基因2118

7、 bp，經(jīng)NCBI比對(duì)所得到的SRK序列為S7單倍型。利用同源重組技術(shù)，分別構(gòu)建了CML49與SRK7的原核表達(dá)載體pCold(I)-CML49和pGEX-SRK7。融合蛋白體外表達(dá)純化，PμLl-down表明兩融合蛋白在體外能夠進(jìn)行相互作用。
　　同時(shí)分別構(gòu)建CML49與SRK7（不含信號(hào)肽）的酵母表達(dá)載體pGBKT7-CML49和pGADT7-SRK7。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中，得到酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGo

8、ld(pGBKT7-CML49)和Y187(pGADT7-SRK7)，經(jīng)過毒性及自激活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無自激活和毒性現(xiàn)象。融合的二倍體酵母Y2HGold(pGBKT7-CML49)和Y187（pGADT7-SRK7）能在選擇型培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/AbA(DDO/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)上正常生長(zhǎng)、且在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)變藍(lán)色。β

9、-半乳糖苷酶活性測(cè)定表明CML49與SRK7相互作用的酶活性18.44。綜上說明，結(jié)球甘藍(lán)CML49與SRK7蛋白能夠相互作用。
　　4.CML49與胞內(nèi)激酶域(iSRK7)、胞外域(eSRK7)相互作用檢測(cè)
　　從全長(zhǎng)SRK7上亞克隆了胞內(nèi)激酶域（不含跨膜域，iSRK7）750 bp和胞外域（不含信號(hào)肽，eSRK7）1245 bp2個(gè)SRK7亞結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-iSRK7和pGEX-eSRK7，進(jìn)行原核表達(dá)

10、，純化融合蛋白，并進(jìn)行體外相互作用檢測(cè)，結(jié)果表明CML49能與eSRK7發(fā)生相互作用且相互作用強(qiáng)度很強(qiáng)，而與iSRK7沒有檢測(cè)到發(fā)生相互作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，分別構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-CML49、pGADT7-iSRK7、pGADT7-eSRK7及互換載體pGADT7-CML49、pGBKT7-iSRK7、pGBKT7-eSRK7，并轉(zhuǎn)化對(duì)應(yīng)的酵母菌株。結(jié)果顯示二倍體酵母Y2HGold(pGBKT7-CML49)×Y1

11、87（pGADT7-eSRK7）和Y187（pGADT7-CML49）×Y2HGold(pGBKT7-eSRK7)，在QDO/X/A培養(yǎng)基上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落且生長(zhǎng)速度很快，反應(yīng)較為強(qiáng)烈，同時(shí)激活了酵母的報(bào)告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。而Y2HGold(pGBKT7-CML49)×Y187(pGADT7-iSRK7)和Y187(pGADT7-CML49)×Y2HGold(pGBKT7-iSRK7)，生長(zhǎng)速度緩慢，幾乎觀察不

12、到藍(lán)色菌斑產(chǎn)生。通過β-半乳糖苷酶活性測(cè)定表明:CML49與eSRK7能夠相互作用且強(qiáng)度較強(qiáng)，而CML49與iSRK7相互作用較弱。表明CML49與SRK7的相互作用的核心區(qū)域?yàn)榘庥?，而不是胞?nèi)激酶域iSRK7。
　　5.CML49 EF-hand突變體與SRK7、eSRK7及iSRK7相互作用檢測(cè)
　　將CML49蛋白兩個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域中重要的氨基酸突變，使EF1的谷氨酸Glu-170(E)突變?yōu)楣劝滨０稧ln-1

13、70(Q)，然后突變CML49使EF2的谷氨酸Glu-236(E)突變?yōu)楣劝滨０稧ln-236(Q)，最后突變兩者，構(gòu)建3種突變體，分別命名為CML49-1-、CML49-2-和CML49-12-三種突變體。構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold I-CML49-1-、pCold I-CML49-2-、pColdI-CML49-12-及pGEX-iSRK7、pGEX-eSRK7。進(jìn)行原核表達(dá)，純化融合蛋白，并進(jìn)行體外相互作用檢測(cè)，表明CML49突變

14、體均不能與SRK7、iSRK7和eSRK7發(fā)生相互作用。同時(shí)構(gòu)建酵母表達(dá)載體 pGBKT7-CML49-1-、 pGBKT7-CML49-2-、 pGBKT7-CML49-12-及pGADT7-SRK7、pGADT7-iSRK7、pGADT7-eSRK7。結(jié)果進(jìn)一步支持了原核表達(dá)體外相互作用檢測(cè)結(jié)果。
　　6.番茄花粉特異性啟動(dòng)子LAT52的克隆及功能分析
　　根據(jù)番茄（S.lycopersicum）花粉特異性啟動(dòng)子LAT5

15、2序列(GenBank: X15855)設(shè)計(jì)引物，從番茄基因組DNA中擴(kuò)增得到花粉特異性啟動(dòng)子核心序列608 bp。序列分析表明其中含有多個(gè)花粉特異性元件。將LAT52啟動(dòng)子替換35S啟動(dòng)子連接到雙元表達(dá)載體pBI121，命名為pBI-LAT52，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。蘸花法侵染擬南芥花序，獲得T0代種子，抗性篩選后獲得T1代擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)侵染甘藍(lán)幼苗下胚軸。以pBI121載體作為陽性對(duì)照，在適當(dāng)?shù)腗S培養(yǎng)基上經(jīng)預(yù)培

16、養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、脫菌、篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、成苗、移栽等，獲得轉(zhuǎn)化甘藍(lán)植株。對(duì)甘藍(lán)植株花蕾、花藥及花粉進(jìn)行GUS染色，與陽性對(duì)照和陰性對(duì)照相比，僅在花藥和花粉中檢測(cè)到藍(lán)色，說明花粉特異性啟動(dòng)子LAT52僅能夠在花粉中特異性表達(dá)，且該啟動(dòng)子可以在甘藍(lán)花粉中特異性表達(dá)。
　　7.甘藍(lán)CML49反義基因表達(dá)載體構(gòu)建對(duì)甘藍(lán)反義轉(zhuǎn)化
　　根據(jù)CML49基因全長(zhǎng)序列，克隆得到反義CML49基因，并結(jié)合植物雙元載體pCAMBIA130

17、2的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物并添加適當(dāng)酶切位點(diǎn)。構(gòu)建反義表達(dá)載p1302-LAT-aCML49、反義p1302-35S-aCML49，空載體作為陽性對(duì)照，轉(zhuǎn)化甘藍(lán)幼苗下胚軸，在適當(dāng)?shù)腗S培養(yǎng)基上經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、脫菌、篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、成苗、移栽等，獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)反義植株。
　　8.甘藍(lán)CML49反義基因轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察
　　提取轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株基因組DNA，設(shè)計(jì)引物分別檢測(cè)T-DNA區(qū)域內(nèi)的CaMV35

18、S啟動(dòng)子、Hyg(Ⅱ)潮霉素抗性基因、LAT52啟動(dòng)子及反義目的基因片段。經(jīng)PCR檢測(cè)，均檢測(cè)到正確的目的片段，初步說明T-DNA區(qū)域片段成功轉(zhuǎn)化甘藍(lán)。設(shè)計(jì)探針引物，經(jīng)Southern blot分析進(jìn)一步確定對(duì)甘藍(lán)的轉(zhuǎn)化，且以雙拷貝整合到甘藍(lán)植株基因組中。轉(zhuǎn)基因植株甘藍(lán)花粉原位萌發(fā)顯示p1302-35S-aCML49和p1302-LAT-aCML49轉(zhuǎn)基因植株柱頭上萌發(fā)的花粉數(shù)量較少，且花粉管大部分不能正常生長(zhǎng)或生長(zhǎng)速度較慢，僅可以觀察