海島棉莖尖的基因槍轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。傳統(tǒng)的棉花育種方法發(fā)展到今天,面臨著種質(zhì)資源貧乏、遠(yuǎn)緣雜交困難等問(wèn)題,利用基因工程技術(shù)改良棉花品種越來(lái)越受到廣泛關(guān)注?；驑尳閷?dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種轉(zhuǎn)化技術(shù),它具有無(wú)宿主限制、靶材料范圍廣泛、可控度高、快速等優(yōu)點(diǎn)。然而,利用基因槍介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化仍然存在很多問(wèn)題,如海島棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生困難、基因型依賴性、轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)等。因此,建立高效的基因槍介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)棉花轉(zhuǎn)基因育種具

2、有重要意義。
　　本研究以新疆自育海島棉品種新海13號(hào)莖尖和新陸早33號(hào)胚性愈傷組織為受體材料進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化,研究基因槍轉(zhuǎn)化的影響因素,建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系;探索海島棉愈傷組織分化的有效途徑,為新疆棉花育種奠定一定基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1、以海島棉新海13號(hào)莖尖分生組織為轟擊受體,建立了基因槍法轉(zhuǎn)化技術(shù)體系:取暗培養(yǎng)4d,光照培養(yǎng)1d的無(wú)菌苗莖尖作為靶材料,以直徑為1.0μm、DNA包裹濃度為1.5μg/

3、μL的金粉為微載體,在滲透培養(yǎng)基MSBGS中前滲12h后,選擇真空度28inchHg、轟擊壓力1100psi、轟擊距離6cm進(jìn)行基因槍的轟擊;之后在滲透培養(yǎng)基MSBGS中后滲處理16h,恢復(fù)培養(yǎng)基MSBHF中恢復(fù)24h;移至卡那霉素抗性篩選濃度為120mg/L的篩選培養(yǎng)基,篩選時(shí)間為35d左右。在添加4g/L活性炭粒的生根培養(yǎng)基MSBSG-1中誘導(dǎo)抗性幼苗生根,獲得抗性再生植株。經(jīng)過(guò)PCR和RT-PCR檢測(cè),共得到6株轉(zhuǎn)基因再生植株,證

4、明抗除草劑基因EPSPS在轉(zhuǎn)基因植株中得到表達(dá)。
　　2、以陸地棉品種新陸早33號(hào)的胚性愈組織為受體,進(jìn)行基因槍遺傳轉(zhuǎn)化,前滲處理4h,后滲處理16h,轟擊壓力1100psi,轟擊距離6cm,真空度28inchHg,恢復(fù)培養(yǎng)24h后,在卡那霉素濃度為60mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng),誘導(dǎo)生根后獲得抗性植株,經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè),獲得7個(gè)PCR陽(yáng)性再生苗,初步證明抗除草劑草甘膦基因EPSPS已轉(zhuǎn)入新陸早33號(hào)基因組中。
　　3、五個(gè)

5、海島棉品種在六種不同的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Y0-Y5)中均可以誘導(dǎo)出愈傷組織,但不同的品種在相同的培養(yǎng)基中誘導(dǎo),愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)有較大差異。新海13號(hào)無(wú)菌苗的胚根、下胚軸和子葉在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基Y5(0.1mg/LKT,0.1mg/L2,4-D和0.1mg/LNAA)中都可以誘導(dǎo)出疏松的愈傷組織,愈傷組織的生長(zhǎng)速度下胚軸大于子葉,子葉大于胚根。激素濃度和配比對(duì)新海13號(hào)愈傷組織的生長(zhǎng)影響較大,誘導(dǎo)愈傷組織分化的培養(yǎng)基Y1-1(0.05mg/