海島棉VWR基因的克隆和抗黃萎病功能研究.pdf

1、我國棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳維管束真菌病害，嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。種植抗黃萎病的棉花品種是最經(jīng)濟有效的防治方法。作為世界兩大主要栽培棉種的陸地棉和海島棉在農(nóng)藝性狀上具有顯著的差別，陸地棉表現(xiàn)產(chǎn)量高、適應性強但缺乏免疫或高抗黃萎病的抗源材料，海島棉具有對黃萎病免疫或高抗且品質(zhì)優(yōu)良的特點。將海島棉黃萎病抗性轉育到陸地棉或利用基因工程手段將海島棉的抗病基因轉化到陸地棉中來改良陸地棉的抗病性是現(xiàn)代棉花抗病育種的重要策略之一。因此研究分離

2、鑒定海島棉抗黃萎病相關基因并研究其功能對于抗黃萎病分子育種具有重要意義。
　　本研究通過篩選黃萎病菌脅迫下的海島棉全長cDNA文庫和陸地棉SSH文庫，獲得2個與黃萎病菌脅迫相關的基因，Blast比對發(fā)現(xiàn)該基因目前沒有任何解讀信息，我們將海島棉中該基因命名為GbVWR1和GbV WR2。為了明確GbVWR基因在棉花抗黃萎病中的作用，本研究分別對GbVWR1和GbVWR2基因進行克隆，組織表達特異性分析、黃萎病菌脅迫及激素誘導下的基因

3、表達，利用病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術研究其抗黃萎病功能。主要研究結果如下:
　　1.克隆獲得海島棉GbVWR1和GbVWR2全長序列，對應的ORF分別為198bp和720bp;分別編碼65個和239個氨基酸殘基的蛋白;GbVWR1含有一個信號肽和一個跨膜域，而GbVWR2無信號肽和跨膜域。
　　2.生物信息學分析啟動子相關作用元件發(fā)現(xiàn)，GbVWR1的啟動子含有響應真菌誘導、赤霉素和類黃酮生物合成等相關的順式作用元件;

4、GbVWR2的啟動子含有響應真菌誘導、茉莉酸、赤霉素、水楊酸、和植物逆境防御反應的順式作用元件。
　　3.利用qRT-PCR分析基因的組織表達特性以及受黃萎病菌和激素處理后基因的表達模式。結果顯示GbVWR1和GbVWR2在抗病海島棉Pima90-53、耐病陸地棉農(nóng)大601和感病陸地棉CCRI8的根、莖和葉中均有表達，并且兩個基因在根中的表達量最高。GbVWR1和GbVWR2均受黃萎病菌的誘導表達，GbVWR1受茉莉酸、水楊酸、乙

5、烯和赤霉素上調(diào)表達;而GbVWR2受茉莉酸、水楊酸和乙烯下調(diào)表達，受赤霉素上調(diào)表達。
　　4.構建了融合表達載體pCamE-VWR1∷GFP和pCamE-VWR2∷GFP，基因槍轟擊法轉化洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞。結果表明pCamE-VWR1∷GFP融合蛋白在細胞的細胞膜、核膜、液泡膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位均有明顯的綠色熒光信號，推測GbVWR1蛋白定在膜系統(tǒng)上發(fā)揮功能，pCamE-VWR2∷GFP融合蛋白定位在細胞核。構建了原核表達載體pE

6、T-VWR1、pET-VWR2，經(jīng)終濃度為1.0 mM的IPTG誘導后，SDS-PAGE蛋白電泳顯示重組質(zhì)粒分別表達分子量為25kDa和35kDa左右的特異蛋白條帶。
　　5.通過VIGS技術分別抑制海島棉內(nèi)源GbVWR1和GbVWR2基因的表達，黃萎病菌處理后20天左右，沉默植株比對照表現(xiàn)更為感病，病指增高。說明GbVWR1和Gb VWR2都參與棉花抗黃萎病反應。
　　綜上結果，本研究克隆了海島棉兩個功能未知新基因GbVW