枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立及優(yōu)化.pdf

1、論文以不同品種枇杷為試驗(yàn)材料，以誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)以及愈傷含有的Ursolic Acid（UA）及Oleanic acid（OA）含量為指標(biāo)，選擇適宜枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的品種、外植體以及適宜的激素配比，建立良好的愈傷組織誘導(dǎo)與繼代體系。將該愈傷組織轉(zhuǎn)入液體進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，初步建立枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化，建立適宜枇杷細(xì)胞生長(zhǎng)及UA、OA含量積累的培養(yǎng)體系。主要結(jié)果如下：
　　1、枇杷優(yōu)良愈傷組織的獲得及繼代培養(yǎng)
　　

2、試驗(yàn)從枇杷品種、外植體部位、激素配比、顯微觀察方面研究，獲得枇杷懸浮培養(yǎng)適宜的愈傷，結(jié)果表明：最適宜枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及UA、OA含量積累的枇杷品種為早鐘6號(hào)，雖然含有的UA、OA含量較低（6.898、2.343mg/g.DW），但其誘導(dǎo)率高（83.697%）、愈傷組織嫩黃、疏松、顆粒明顯，為最適枇杷品種。最適外植體為幼胚，花絲誘導(dǎo)率雖高（接近100%），但質(zhì)地堅(jiān)硬；葉片及莖尖的誘導(dǎo)率低；而幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織，誘導(dǎo)率（83.17%）較高。

3、同時(shí)幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織的UA及OA（5.099、1.617mg/g.DW）顯著高于花絲、葉片、莖尖，為最佳外植體。最合適的幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT，繼代培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L2,4-D+0.25mg/LKT。顯微觀察也表明幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織最適用于枇杷懸浮培養(yǎng)。同時(shí)，試驗(yàn)鑒于花絲誘導(dǎo)的優(yōu)越性，對(duì)花絲愈傷組織進(jìn)行調(diào)控，調(diào)控兩代后出現(xiàn)細(xì)軟、嫩黃的愈傷組織，但繼代兩三次后愈傷組織轉(zhuǎn)白，水漬化，

4、狀態(tài)不佳，有待進(jìn)一步研究。
　　2、枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系建立
　　在枇杷細(xì)胞的液體培養(yǎng)中，細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)典型的“S”曲線，培養(yǎng)周期為18d。以細(xì)胞FW增長(zhǎng)倍數(shù)及UA、OA的增長(zhǎng)倍數(shù)為衡量指標(biāo)，對(duì)懸浮培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：懸浮培養(yǎng)最適培養(yǎng)基配方為：MS+NAA0.5mg/L，枇杷細(xì)胞鮮重25.863g.FW，為初始3.577倍，UA及OA含量分別為36.490、6.975mg/g.DW，為初始4.744倍、2.881倍。最

5、適接種量80g/L，pH6.0，碳源濃度30g/L，溫度25℃，光照400Lux，轉(zhuǎn)速130r/min，裝液量130mL/250mL。對(duì)最適激素的考察可知，生長(zhǎng)素NAA>2,4-D>IBA，細(xì)胞分裂素KT>BA，且生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素的單獨(dú)作用效果好于組合作用，及NAA>KT>NAA、KT。同時(shí)，試驗(yàn)研究了誘導(dǎo)子對(duì)枇杷細(xì)胞生長(zhǎng)及UA、OA含量的影響，結(jié)果表明100mg/LMJ的加入為試驗(yàn)中最適宜的誘導(dǎo)子，鮮重34.65g.FW，UA及OA

6、含量33.089、6.496mg/g.DW，分別為對(duì)照CK的1.080、2.540、2.590倍。綜上，試驗(yàn)建立了適宜的枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。
　　3、 UA及OA含量的提取與測(cè)定
　　試驗(yàn)在枇杷葉UA及OA超聲提取方法的基礎(chǔ)上改良，以95%乙醇為溶劑，對(duì)UA、OA的超聲提取方法進(jìn)行優(yōu)化，得到最適的提取方法為：超聲功率50W、超聲時(shí)間25min、料液比1:40、超聲次數(shù)2次。在此方法下，測(cè)得枇杷細(xì)胞內(nèi)UA及OA的超聲提取率分