龍眼胚性愈傷組織SOD的表達分析及啟動子功能鑒定.pdf

1、龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是我國南方一種重要的熱帶亞熱帶果樹。植物在生長發(fā)育過程中，為了消除逆境及自身生理代謝所帶來的有害的自由基和活性氧，自身的保護酶系統(tǒng)將發(fā)揮其巨大作用。SOD是保護酶系統(tǒng)中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶，不同類型的SOD基因會隨著植物生長過程以及外界環(huán)境或因子的變化而出現(xiàn)差異表達。在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究從16個龍眼品種誘導胚性愈傷組織（embryogenic callus，EC），進行龍眼

2、EC在離體保存、非生物脅迫條件及多種激素處理下EC SOD在轉(zhuǎn)錄和蛋白（酶活性）水平的變化檢測；采用轉(zhuǎn)化煙草的方法，進行不同類型SOD不同缺失片段的啟動子的SOD啟動子功能鑒定研究，并進一步進行龍眼EC轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化研究，為進一步探討龍眼EC SOD的功能與作用機制，并為今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)直接轉(zhuǎn)化龍眼提供參考。主要研究結(jié)果如下：
　　1、龍眼胚性愈傷組織的誘導及其限制生長保存條件下的生長狀況比較
　　本研究首先對福建省的龍眼

3、主要栽培品種及地方品種進行胚性愈傷組織的誘導，其中7個品種是采自泉州農(nóng)科院的地方品種，包括‘泉龍160（柴螺系列）’、‘泉龍313（東壁系列）’、‘石硤’、‘泉龍138（烏龍嶺系列）’、‘泉龍142’、‘東壁’和‘泉龍114（儲良系列）’；另外9個品種是采自莆田果樹所的栽培品種，包括‘03晚優(yōu)’、‘松風本’、‘莆田-石硤’、‘油潭本’、‘龍優(yōu)’、‘莆田-東壁’、‘云本’、‘青殼寶圓’和‘雞蛋本’。結(jié)果顯示，16個品種的龍眼EC均已誘導得

4、到，隨后比較限制生長條件下不同品種龍眼EC的生長情況，結(jié)果表明11個品種的龍眼EC生長狀況相對比較良好并能延長其繼代周期到50 d，包括‘紅核子’、‘龍優(yōu)’、‘松風本’、‘油潭本’、‘青殼寶圓’、‘云本’、‘雞蛋本’、‘泉龍313（東壁系列）’、‘泉龍142’、‘泉龍160（柴螺系列）’、‘泉龍114（儲良系列）’。另外6個品種的龍眼EC生長狀況相對較差并不能延長繼代周期到50 d，包括‘石峽’、‘東壁’、‘莆田-東壁’、‘莆田-石峽’

5、、‘03晚優(yōu)’、‘泉龍138（烏龍嶺系列）’。
　　2、龍眼EC SOD在不同生理條件下的酶活性變化
　　2.1限制生長保存和普通保存過程中的EC的SOD活性變化
　　以紅核子、云本、石峽EC為試材，它們在常規(guī)保存和限制保存培養(yǎng)基上的SOD活性變化檢測結(jié)果顯示，限制保存能有效延緩龍眼EC的衰老，能明顯推遲了SOD活性峰值出現(xiàn)的時間，紅核子和云本的SOD活性峰值可以由常規(guī)保存時的30 d推遲至50 d，而限制保存較不理想

6、的石峽也由30 d推遲至40 d，結(jié)果還顯示SOD活性峰值出現(xiàn)的時間又與龍眼本身的耐衰老能力有關(guān)。
　　2.2不同非生物脅迫及激素處理下龍眼EC的SOD活性變化
　　2.2.1龍眼EC在非生物脅迫中的SOD酶活性變化
　　本研究檢測了聚乙二醇（PEG）、甘露醇、蔗糖、NaCl、不同光質(zhì)的非生物脅迫下龍眼EC的SOD酶活性變化，結(jié)果表明：與對照相比，隨著PEG脅迫強度的增加，SOD活性在輕度(10%PEG)、中度(20%

7、PEG)脅迫下上升，嚴重(30%PEG)脅迫下呈快速下降趨勢；隨著甘露醇濃度的提高，SOD活性不斷升高，且一直維持在一個較高的水平上，直到濃度達到100 g/L時才開始呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢；隨著蔗糖濃度的升高，SOD活性不斷升高，直到蔗糖濃度為70 g/L時開始下降，70~90 g/L之間的SOD活性下降緩慢。甘露醇和蔗糖處理比PEG處理的SOD活性高，下降的速度也較緩慢，說明適當高濃度的甘露醇和蔗糖，可以有效提高植物細胞活力，從而延緩細

8、胞衰老，為龍眼EC離體保存以及提高龍眼的抗旱性等應用提供了重要科學依據(jù)。
　　隨著NaCl濃度的升高，低鹽脅迫下SOD酶活性先上升后下降，而高鹽脅迫下SOD酶活性則呈下降趨勢，低鹽脅迫下SOD酶通過迅速增加活力來保護細胞，在防止鹽脅迫傷害中起到很重要的作用。不同光質(zhì)分別處理24 h、72 h，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，龍眼EC的SOD活性逐漸上升，在同樣的光強和處理時間下，白光下的SOD活性是最強的，紅光次之，說明白光可以有效誘導SOD

9、活性的提高，而藍綠光下的SOD活性接近于對照。
　　2.2.2龍眼EC在激素處理中的SOD酶活性變化
　　乙烯利、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯處理的龍眼EC的SOD活性變化均呈先升后降趨勢，乙烯利的峰值出現(xiàn)在30 ppm，IAA出現(xiàn)在1.5 mg/L時，赤霉素的峰值保持在6~12 mg/L間，茉莉酸甲酯出現(xiàn)在100μmol/L時，而水楊酸是升-降-升趨勢，分別在50μmol/L和100μmol/L時出現(xiàn)峰值，以上激素處理的峰值

10、均顯著高于對照，說明植物激素可能通過提高龍眼EC的SOD活性以增強抗逆性。
　　3、龍眼EC SOD在不同生理條件下表達的定量PCR分析
　　3.1龍眼EC在離體保存過程中SOD表達的定量PCR分析
　　以EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a為內(nèi)參基因，用SYBR GreenⅡ熒光染料法的熒光定量PCR法檢測常規(guī)繼代保存過程中龍眼EC的 DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，保存25

11、d時DlCSD1a表達量上升最顯著，DlMSD次之，DlFSD1a有小幅度下降；30 d時DlCSD1a和DlMSD保持穩(wěn)定，DlFSD1a大幅度上升；40 d后3類基因表達量均下降，說明材料有所老化。說明保存20~30 d，龍眼EC的生長主要由不同SOD基因間相互協(xié)調(diào)，此消彼長，相互調(diào)控，以維持龍眼EC SOD的動態(tài)平衡，DlCSD1a一直發(fā)揮著主要調(diào)控作用，DlMSD保持在較高的穩(wěn)定水平，保存30 d時DlFSD1a在抗衰老方面發(fā)揮

12、重要作用。
　　3.2龍眼EC在非生物脅迫及激素處理中SOD表達的定量PCR分析
　　3.2.1龍眼EC在非生物脅迫中SOD表達的定量PCR分析
　　以EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a為內(nèi)參基因，用SYBR GreenⅡ熒光染料法的熒光定量PCR法檢測蔗糖、NaCl和不同光質(zhì)的非生物脅迫處理下龍眼EC的DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，在蔗糖處理下，DlCSD1a起最大作用，D

13、lMSD次之，DlFSD1a保持穩(wěn)定；不同光質(zhì)分別處理24 h、72 h，3類基因的表達量大致為白光＞紅光＞藍光＞綠光，處理24 h時DlCSD1a起主要作用，但隨著光質(zhì)處理時間的延長，其表達量大幅度降低，而DlFSD1a表達量得到提高，DlMSD一直無明顯表達；在鹽脅迫下，DlCSD1a的上調(diào)表達最顯著，DlMSD次之，DlFSD1a基本保持不變。
　　3.2.2龍眼EC在激素處理中SOD表達的定量PCR分析
　　以EF-

14、1a、eIF-4a、DlFSD1a為內(nèi)參基因，用SYBR GreenⅡ熒光染料法的熒光定量PCR法檢測水楊酸、乙烯利、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯激素處理下龍眼EC的DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，DlCSD1a對水楊酸、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯均起到主要應答作用，表達峰值分別出現(xiàn)在水楊酸75μmol/L、IAA1.5 mg/L、赤霉素12 mg/L和茉莉酸甲酯50μmol/L時，DlFSD1a對乙烯

15、、赤霉素無明顯應答，而DlMSD基因?qū)σ蚁┯酗@著應答，峰值出現(xiàn)在乙烯30 ppm。
　　4、龍眼EC不同SOD啟動子的功能鑒定研究
　　4.1農(nóng)桿菌注射滲透法轉(zhuǎn)化煙草葉片的體系優(yōu)化
　　對影響農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化煙草葉片法的多項因素進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，應選擇移栽1個月左右的生長健壯、扎根較深且無枯葉、黃葉的煙草植株作為受體材料，以葉脈側(cè)脈位置作為試驗的侵染部位，農(nóng)桿菌重懸菌液濃度OD600值為0.85，在20 mmol/L

16、MgCl2重懸液添加200μmol/L的乙酰丁香酮，注射3 d后進行瞬時表達檢測。對該體系進行優(yōu)化后，將該方法應用于啟動子的功能鑒定中我們發(fā)現(xiàn)其瞬時表達率明顯提高，且數(shù)據(jù)穩(wěn)定，重復性好。
　　4.214個3’/5’端序列缺失片段SOD啟動子轉(zhuǎn)化煙草葉片及其瞬時表達分析
　　GUS基因的瞬時表達結(jié)果顯示，DlMSD啟動子不同3?/5?端缺失片段中MSD-pro4的活性最強，是CaMV35 S啟動子的0.839倍，MSD-pro

17、2最弱。DlFSD1a啟動子不同3?/5?端缺失片段中 FSD-pro4的活性最強，是CaMV35 S啟動子的0.887倍，F(xiàn)SD-pro2最弱。DlCSD1a啟動子不同3?/5?端缺失片段中 CSD-pro5的活性最強，是 CaMV35 S啟動子的0.566倍， CSD-pro3最弱。綜上，F(xiàn)SD-pro4是其中GUS活性最高的。
　　4.3 SOD啟動子轉(zhuǎn)化煙草葉片的GUS基因表達的定量PCR分析
　　以18S rRNA

18、為內(nèi)參基因，用SYBR GreenⅡ熒光染料法的熒光定量PCR法檢測不同類型SOD啟動子不同缺失片段調(diào)控下煙草葉片GUS基因的相對表達量，結(jié)果顯示DlMSD啟動子不同3?/5?端缺失片段中MSD-pro4啟動GUS基因的能力最強，MSD-pro3最弱；DlFSD1a啟動子不同3?/5?端缺失片段中FSD-pro4最強，F(xiàn)SD-pro3啟動子的能力最弱；DlCSD1a啟動子不同3?/5?端缺失片段中CSD-pro5的活性最強，CSD-pr

19、o3最弱。與GUS瞬時表達檢測結(jié)果一致的是FSD-pro4是其中啟動GUS基因的能力最強的。
　　5、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化龍眼體系的優(yōu)化
　　利用篩選出的啟動GUS基因最強的FSD-pro4啟動子，在前人已建立的農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化龍眼的基礎(chǔ)上，采用GUS熒光活性檢測法，進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系，以期能定量而準確地確定轉(zhuǎn)化體系中多個因素，得到最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系。以在2,4-D濃度0.3 mg/L培養(yǎng)18 d的龍眼EC作為受體材料，在添加了50μmo