水稻胚性愈傷組織分化相關基因的研究.pdf

1、水稻（Oryza sativaL.）是我國主要的糧食作物之一，也是一種在科學研究中常用的模式生物。常規(guī)的水稻遺傳育種大大的限制了水稻功能基因組學的發(fā)展，而轉基因技術的飛速發(fā)展與應用則對水稻的轉基因育種產(chǎn)生了深遠影響。到目前為止，成熟的水稻轉基因技術僅僅應用于少數(shù)幾種粳稻品種，如ZH11，日本晴等。對于目前一些具有轉基因改良價值的秈稻品種，如93-11，其轉基因效率卻是十分低的。因而對一些重要的水稻品種進行組織培養(yǎng)能力和基因轉化效率的探索

2、成為目前水稻轉基因技術研究的一個重要方向。而新一代的基因編輯技術CRISPR/Cas9，因其能夠對植物基因組特定位點進行準確的定點編輯，為探索水稻胚性愈傷分化相關基因的研究工作提供了有力的工具。
　　本研究主要通過兩個方面對水稻胚性愈傷分化相關基因的研究工作進行了相關探索。一是通過對ZH11分化一段時間的愈傷進行轉錄組測序和i-TRAQ分析，篩選到一些可能和水稻胚性愈傷分化相關的基因。二是對一些可能和水稻胚性愈傷分化相關基因進行C

3、RISPR/Cas9基因敲除。
　　1.通過對水稻品種ZH11的分化時期的胚性愈傷提取RNA并做了轉錄組測序和i-TRAQ分析，找到了若干個和水稻胚性愈傷分化相關的基因，RicexPro網(wǎng)站上的基因編號分別為 LOC_Os04g33240（TFT12），LOC_Os05g05930（TFT14），LOC_Os05g28210（EMP）。
　　2.通過對TFT12和TFT14這兩個基因的突變體材料和對應的野生型材料進行再生能力

4、差異對比，發(fā)現(xiàn)在愈傷誘導水平上突變體材料和野生型材料之間并未有明顯差異，但是在突變體材料的再生能力明顯低于野生型材料。
　　3. TFT12基因編碼區(qū)全長為828bp，實時定量PCR分析TFT12主要在生殖生長的葉、根、內稃處高表達；TFT14基因編碼區(qū)全長為582bp，實時定量PCR分析TFT14主要在胚以及胚乳處高表達；EMP基因編碼區(qū)全長為288bp，實時定量PCR分析EMP主要在胚及胚乳高表達。
　　4. EMP基因

5、在野生型材料ZH11的水稻種胚萌發(fā)的48hr過程中，其表達量是逐漸上升的，但是在轉基因材料EMPi在添加了誘導劑β-雌二醇的情況下萌發(fā)，該基因的表達量是先升高之后在下降。
　　5.在 EMPi材料種胚萌發(fā)過程中，轉基因材料在添加了誘導劑β-雌二醇的情況下萌發(fā)率相對于野生型水稻的種胚的萌發(fā)率會出現(xiàn)一定程度的下降。
　　6. EMP基因表達的蛋白質含95個氨基酸，蛋白質分子量約為10kDa，我們通過NCBI數(shù)據(jù)庫找到了玉米、小麥

6、、擬南芥等的同源蛋白序列，并構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　7.同樣是基于轉錄組測序和i-TRAQ分析，找到了另外一些基因的表達量發(fā)生較為明顯的變化，其中CKO1（LOC_Os01g09260）和Cht2（LOC_Os05g33130)表達量上調，而IAA20(LOC_Os06g07040)表達量下調。
　　8.利用本實驗室自主創(chuàng)建的簡便、高效的多靶點編輯 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，分別對 Cht2和 IAA20這兩個基因構建了單