豬窖蛋白-1基因在小鼠成肌細胞系中的表達調控機制.pdf

1、小窩蛋白(caveolin)是分子量為21-24kDa的膜整合蛋白，是胞膜窖的包被結構成分。小窩蛋白家族含有三個成員，分別是caveolin-1、caveolin—2及caveolin—3。ceveolin-1在膽固醇平衡方面有重要作用，但是，其自身的轉錄調控并沒有深入闡明，尤其在豬的研究中，較少報道，這成為進一步揭示其功能和利用其進行相關方面的應用的制約因素。有鑒于此，我們希望通過本論文的內容，推進豬caveolin-1基因的轉錄調控

2、研究。 首先采用PCR(polymerase chain reaction)技術從豬基因組DNA中克隆到caveolin-1基因5’側翼轉錄調控區(qū)，并設計多條引物，得到不同長度的DNA片段-1756～—260，將它們分別克隆到pGL3-Basic載體中。轉染C2C12細胞系之后，得到活性最高的是pGLB—260。再根據(jù)生物信息學分析結果，針對caveolin-1基因5’側翼區(qū)特定區(qū)段進行嵌套缺失和定點突變，獲得了系列缺失子和突變

3、子。然后應用DLR系統(tǒng)研究鑒定了小鼠成肌細胞系C2C12中調控caveolin-1基因基礎表達的順式作用元件及其轉錄因子。 通過生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)在—210～—200有一個潛在HOXA1位點，-193～-184和-124～-114分別由一個潛在的Sp1位點(編號分別為Sp1.2和Sp1.3)，-141～-134有一個潛在的AP1位點。 用pGLB—213和pGLB-149做模板，將這些潛在的位點單點突變或雙位點突變

4、，以便檢測關鍵的順式元件。試驗結果顯示，用pGLB—213作為模板，突變HOXA1或Sp1.2位點后，其活性分別降低50％左右；突變AP1位點后，活性降低30％左右；突變Sp1.3后，活性降低90％左右，基本與pGL3-Basic水平相當。用pGLB-149作為模板，突變Sp1.3后，其活性降低約90％，基本與pGL3-Basic水平相當。這表明Sp1.3位點(-123～-113)是一個在CAV1的轉錄調控中的一個極其重要的位點。

5、 針對caveolin-1基因核心啟動子元件，設計了對應于Sp1.3的探針(-130～-105)進行EMSA(electrophoretic mobility shift assay)實驗，發(fā)現(xiàn)這段寡核苷酸可與C2C12細胞核中的某種核蛋白結合，形成DNA-蛋白質復合物。加入抗Sp1抗體，結合帶位置條帶減弱，表明DNA—蛋白復合物中的蛋白是Sp1。 另外，由于生物信息學分析表明，在—70～—50和—30～—20區(qū)域內分別含有C

6、CAATbox和TATAbox，為了驗證這一預測，將這兩個位點突變，發(fā)現(xiàn)CCAATbox突變后相對熒光素酶活性下降及其顯著，幾乎與pGLB的水平相當。而TATAbox突變后，相對熒光素酶活性有輕微降低。 本論文是對豬caveolin-1基因在C2C12細胞系中的表達調控機制的首次系統(tǒng)研究。通過本研究，找到了調控caveolin-1基因基礎表達的核心啟動子元件區(qū)-130～-105區(qū)段和—70～—50區(qū)段，對caveolin-1基因