過表達LCN-2卵巢癌細胞系的構建及影響.pdf

1、目的:
　　卵巢癌在婦科的惡性腫瘤中病死率極高，是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性健康。雖然診斷方法仍在不斷的改進，但是卵巢癌的易復發(fā)及伴隨出現的轉移和多重耐藥性，嚴重影響到卵巢癌的治療效果。由于在患病早期無特異性癥狀，缺乏有效的早期診斷措施，大部分患者確診時已多處于晚期，讓患者錯過了最佳的治療時機。為了能夠做到早診斷早治療，在早期有一些腫瘤抗原標記物，例如經典的CA125、CA199等，對于不同類型、不同部位的腫瘤大

2、多伴有不同程度的變化。特別是一些腫瘤標記物隨著惡性程度的增加有相應規(guī)律的變化，雖不具有普遍性，但已經對卵巢癌的早期診斷、治療及手術預后療效的改善給予了極大的參考意見。
　　脂質運載蛋白-2(lipocalin-2，LCN-2)，是分泌型糖蛋白，又命名為中性粒細胞明膠相關脂質運載蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL)，屬于脂質運載蛋白家族的第2號成員。研究發(fā)現，LCN-2

3、的上調與多種人類腫瘤相關，包括肝癌，乳腺癌，子宮內膜癌和卵巢癌。然而，LCN-2在腫瘤細胞中的生物學作用還不是很清楚。本研究通過過表達LCN-2的方法來檢測其對卵巢癌細胞增殖的影響，探討LCN-2在卵巢癌中的表達和發(fā)展規(guī)律，為進一步研究LCN-2在卵巢癌細胞中的作用機制提供信息平臺，以及為治療卵巢癌提供更多有價值的信息。
　　方法:
　　Western Blot分析檢測四種細胞系中(CAOV3，ES2，OVCAR3，SKOV

4、3) LCN-2蛋白水平上的表達;瞬時轉染LCN-2質粒后通過WesternBlot分析檢測過表達LCN-2在卵巢癌細胞ES2中的蛋白表達;進行G418篩選，探測未轉染質粒的ES2細胞的生存臨界濃度;采用穩(wěn)定轉染法觀察過表達LCN-2在卵巢癌細胞中的生長狀況，通過G418的篩選建立穩(wěn)定過表達LCN-2的ES2細胞系;MTT細胞增殖試驗檢測過表達LCN-2對卵巢癌細胞增殖的影響。
　　結果:
　　1 Western Blot檢

5、測四種卵巢癌細胞系（CAOV3，ES2，OVCAR3，S- KOV3)LCN-2表達情況，CAOV3和OVCAR3呈高表達，ES2未表達，SKOV3較低表達
　　Western Blot檢測這四種卵巢癌細胞系LCN-2表達情況，CAOV3和OVCAR3明顯表達，ES2未表達，SKOV3無明顯表達。常規(guī)細胞培養(yǎng)后，鏡下觀察四種細胞系的生長狀態(tài)，CAOV3和OVCAR3細胞形態(tài)大多為菱形和多邊形上皮樣細胞狀，ES2細胞形態(tài)呈橢圓形，S

6、KOV3呈梭狀上皮樣細胞形態(tài)。
　　2 構建pcDNA3.1/mycHis-LCN-2質粒DNA后，采用瞬時轉染法，驗證質粒及LCN-2抗體的可用性
　　首先我們用實驗室已有的空載體pcDNA3.1/mycHis-LACZ和PEGFP-N3，分別構建了pcDNA3.1/mycHis-LCN-2和PEGFPN3-LCN-2重組質粒DNA。因LCN-2在ES2細胞中不表達，所以選擇ES2做瞬時轉染，pcDNA3.1/mycHis

7、-LCN-2，PEGFPN3-LCN-2作為實驗組;pcDNA3.1/mycHi-s-LACZ，PEGFPN3作為對照組，24小時后全部收獲，Western Blot分析檢測轉染LCN-2的實驗組均明顯過表達，充分可以說明LCN-2質粒構建成功，抗體結合良好。
　　3 G418藥物濃度檢測ES2產生耐藥的生長臨界濃度是700μg/ml。
　　G418藥物濃度梯度（200μg/ml，400μg/ml，600μg/ml，900μ

8、g/ml,1200μg/ml，1500μg/ml）置于六孔板中，觀察7天后發(fā)現ES2產生耐藥的生長臨界濃度為700μg/ml。
　　4 成功構建LCN-2穩(wěn)定過表達的ES2細胞系
　　瞬時轉染的預實驗成功后，穩(wěn)定轉染ES2細胞系，用700μg/ml G418進行篩選，約兩周后克隆形成。選擇生長狀態(tài)良好的細胞團進行增殖，收獲后Western Blot分析檢測發(fā)現LCN-2在＃2，＃3，＃12，＃14，＃21，＃22，＃23和＃

9、31細胞株中的表達相對于V1，V2，V3和V7中明顯升高。Western Blot再次分析驗證了LCN-2在＃2，＃3，＃31和＃23中的穩(wěn)定過表達，并鏡下觀察發(fā)現ES2細胞株和穩(wěn)定轉染LCN2后的ES2形態(tài)無明顯變化。
　　5 MTT細胞增殖試驗發(fā)現LCN-2有促進卵巢癌細胞增殖的作用
　　我們選取穩(wěn)定過表達LCN-2的＃2和＃3的兩個細胞株作為實驗組;空載體V1和V2的細胞株作為對照組，經過6天的連續(xù)檢測，LCN-2過表

10、達組，相對于對照組，細胞的增殖速度明顯加快，差異具有統計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1 成功構建了pcDNA/mycHis-LCN-2和PEGFPN3-LCN-2表達載體。
　　2 LCN-2在卵巢癌細胞系中的表達差異，對于研究LCN-2在卵巢癌中的作用具有重要的價值。
　　3 LCN-2的抗體與抗原結合良好，抗體效價較高。
　　4 構建的LCN-2穩(wěn)定過表達的細胞系為以后進一步研究LCN-2