豬APOA2和SEPW1基因的轉錄調控分析.pdf

1、豬，是我們獲取動物蛋白質的主要來源。豬肉品質好壞直接影響著口感。隨著生活水平的提高，人們對豬肉品質的要求也有所提高。因此，通過分子育種的方法改善豬的肉質性狀是當前比較熱門的一項研究課題。為此，我們在分子水平上對豬的脂肪相關基因APOA2和肌肉相關基因SEPW1進行了相關性研究，主要集中在基因的啟動子區(qū)域進行轉錄調控分析。所得的結果如下所述:
　　(1)豬APOA2和SEPW1基因在豬不同組織中表達情況的研究。主要采用實時定量PCR

2、的方法進行檢測，并建立了組織表達譜。結果為:豬APOA2基因主要在肝臟中表達，并且表達量很高;在脂肪中也有微量的表達;在其它組織中表達量極低，可忽略不計。豬SEPW1基因在各個組織中均有不同程度的表達，而在心臟和腓腸肌組織中表達量最高，在脾臟中表達量最低。
　　(2)豬APOA2和SEPW1基因5'側翼調控序列的克隆。我們參照NCBI上提供的基因5'側翼調控序列進行引物設計，以豬基因組DNA為模板，克隆了豬APOA2基因1919b

3、p和SEPW1基因1993bp的序列。序列克隆結果與NCBI上提供的序列進行比對，相似度均達到99％。
　　(3)豬SEPW1基因啟動子CpG島甲基化情況研究。通過MethPrimer軟件預測豬APOA2和SEPW1基因啟動子區(qū)域的CpG島，在APOA2基因啟動子序列中沒有發(fā)現(xiàn)CpG島，而SEPW1基因啟動子序列中有3個CpG島。對位于SEPW1基因啟動子的-751～-483區(qū)域的CpG島進行了克隆分析，甲基化水平均較低。

4、　　(4)啟動子活性研究。我們構建了APOA2基因啟動子區(qū)域的7個不同長度的雙熒光素酶報告基因載體，以及SEPW1基因啟動子區(qū)域的6個不同長度的雙熒光素酶報告基因載體。轉染細胞，檢測熒光活性，發(fā)現(xiàn)APOA2基因啟動子的-208～-21、-813～-209這兩個區(qū)域分別能夠獨立起始轉錄，SEPW1基因核心啟動子位于-443～+27區(qū)域內。
　　(5)轉錄因子結合位點的分析預測。我們對可能含有正調控元件的區(qū)域繼續(xù)進行缺失分析，并結合生

5、物信息學方法，得出在APOA2基因-601～-565區(qū)域內含有GATA1轉錄因子結合位點，在SEPW1基因-378～-306區(qū)域內含有SP1結合位點。
　　(6)我們突變了GATA1結合位點的3個堿基，轉染PK細胞，發(fā)現(xiàn)突變后的片段活性顯著低于未突變片段的活性;轉染C2C12細胞時，突變后的片段與原片段相比，活性極顯著降低。對于SP1的結合位點，我們突變了單個堿基，轉染PK細胞，發(fā)現(xiàn)突變載體的活性極顯著降低。
　　(7)分別