轉(zhuǎn)錄因子GATA-1-2對HCMV潛伏相關(guān)基因LUNA及UL126a轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過建立人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人單核白血病細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）潛伏及激活的細(xì)胞感染模型，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChromatinImmnuoprecipitation，ChIP)、免疫印跡(Western blot)和發(fā)夾狀RNA(shRNA)干擾等技術(shù)，分析HCMV潛伏及激活感染后轉(zhuǎn)錄因子GA TA-1與GATA

2、-2的表達(dá)及其與HCMV LUNA及UL126a基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系，明確GATA-1與GATA-2對HCMV LUNA及UL126a基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，為闡明HCMV潛伏及激活感染的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.HCMV潛伏與激活感染模型的建立
　　利用HCMV AD169株感染THP-1細(xì)胞(1×106/ml，MOI=3)，37C、5％CO2的條件下培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h和96h收集細(xì)胞，提取總

3、DNA、總RNA與蛋白。Real-time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)HCMV DNA拷貝數(shù);RT-PCR檢測HCMV IE1(UL123)和UL83 mRNA的表達(dá)。
　　采用佛波酯(PMA，100 ng/μl)刺激HCMV潛伏感染THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，分別于24h、48h、72h和96h搜集細(xì)胞，提取總DNA、總RNA與蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)HCMV DNA拷貝數(shù);RT-PCR檢測HCMV IE1(UL123)和UL

4、83 mRNA的表達(dá)。綜合判斷HCMV在THP-1細(xì)胞中的感染狀態(tài)。2.轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2對HCMV LUNA與UL126a基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
　　Western blot檢測HCMV潛伏及激活感染THP-1細(xì)胞24h、48h、72h和96h后轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2的表達(dá);ChIP分析轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2與HCMV LUNA及UL126a基因5'上游啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況;RT-PCR檢測H

5、CMV LUNA及UL126a基因的表達(dá)。
　　3.shRNA干擾對HCMV LUNA及UL126a基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
　　利用具有靶向干擾作用的shRNA分別敲低THP-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2的表達(dá)后，分別檢測HCMV潛伏與激活感染THP-1細(xì)胞LUNA及UL126a基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.建立HCMV潛伏與激活感染細(xì)胞模型
　　HCMVAD169株感染THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)H

6、CMV DNA載量基本不變;HCMV IE1 mRNA在感染后24h開始表達(dá)，其表達(dá)隨著感染時(shí)間增加而降低，UL83 mRNA未見表達(dá)。提示建立了HCMV潛伏感染的細(xì)胞模型。
　　PMA（終濃度為100 ng/μl）刺激HCMV潛伏感染的THP-1細(xì)胞分化后，細(xì)胞內(nèi)HCMV DNA載量隨著感染時(shí)間增加而升高;HCMV IE1 mRNA在感染后24h開始表達(dá)，其表達(dá)隨著感染時(shí)間增加而升高;UL83 mRNA在PMA刺激后第96h開始

7、表達(dá)。提示建立了HCMV激活感染的細(xì)胞模型。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2參與HCMV LUNA與UL126a基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
　　HCMV潛伏及激活感染THP-1細(xì)胞96h后，Western blot檢測顯示，HCMV潛伏感染時(shí)GATA-1與GATA-2的表達(dá)量高于激活感染;ChIP分析結(jié)果顯示，HCMV潛伏感染時(shí)GATA-1及GATA-2與LUNA及UL126a基因5'啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合率均低于激活感染。<

8、br>　　3.shRNA干擾對HCMV LUNA及UL126a基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響
　　靶向GATA-1與GATA-2的shRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞96h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，GATA-1與GATA-2的表達(dá)均明顯降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;RT-PCR檢測結(jié)果顯示，HCMV LUNA與UL126a基因的表達(dá)均出現(xiàn)明顯的下降;且干擾后HCMV潛伏感染時(shí)LUNA與UL126a基因的表達(dá)明顯低于激活感染。
　　結(jié)