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文檔簡介
1、細(xì)胞質(zhì)甘油磷酸脫氫酶(GPD1,EC1.1.1.8)以NAD+作為電子的供體,催化磷酸二羥丙酮到3-磷酸甘油之間的氧化還原轉(zhuǎn)化反應(yīng)。該反應(yīng)在細(xì)胞質(zhì)中完成,爾后3-磷酸甘油透過線粒體膜,在線粒體中甘油磷酸脫氫酶的作用下,將還原力傳給FAD同時重新生成磷酸二羥丙酮,后者再透過線粒體膜返回到細(xì)胞質(zhì)中。這個循環(huán)稱為3-甘油磷酸穿梭。同時,磷酸二羥丙酮是糖酵解的中間產(chǎn)物,3-磷酸甘油還參與了脂類的從頭合成,在沒有甘油激酶的組織圖肌肉中,GPDI所
2、催化的氧化還原反應(yīng)是3-磷酸甘油的主要來源。因此,細(xì)胞質(zhì)甘油磷酸脫氫酶既參與了跨線粒體膜的電子傳遞,同時還處于糖脂代謝的連接點位置,在機(jī)體能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。本實驗以人類同源的GPD1基因為模板,設(shè)計引物分離了豬GPD1基因的全基因組序列,在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了該基因組織表達(dá)譜分析、染色體定位、亞細(xì)胞定位、啟動子表達(dá)調(diào)控分析及GPDI蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,結(jié)果如下:
(1)首次獲得了豬GPD1基因的全基因組序列,包括5’
3、和3’非翻譯區(qū)以及外顯子與內(nèi)含子部分。豬GPD1基因包括8個外顯子和7個內(nèi)含子,全長約9.3kb。其中啟動子區(qū)長約3.3kb: CDS長l050bp,編碼349個氨基酸。豬CDS序列在不同的物種中有較高的相似性,和牛有99%的相似性,和人與小鼠的相似性分別達(dá)到了90%和89%。用17個真核物種的CDS序列和MEGA4.1的N-J方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,顯示豬和牛有較近的遺傳距離。
(2)利用輻射雜種克隆板將豬GPD1基因定位
4、在5號染色體上。進(jìn)一步的分析把該基因定位于SW2425和GAMMMA分子標(biāo)記中間,而這個區(qū)間內(nèi)有平均背膘厚、日增重、40和60千克背膘厚等的QTL。而亞細(xì)胞定位研究結(jié)果表明,豬GPD1蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中,這和其功能是一致的。
(3)相對實時熒光定量RT-PCR結(jié)果表明,豬GPD1基因Mrna是廣譜表達(dá)的,在所檢測的13個組織中都有表達(dá),但是各組織間表達(dá)量相差很大,達(dá)到兩個數(shù)量級。腸系脂肪、皮下脂肪和十二指腸有較高的表達(dá)量,肝
5、臟、腎臟、大腦等中等表達(dá)量,而心臟、胰臟等組織的表達(dá)量較低。
(4)對從出生到斷奶(21天)后l周仔豬背肌和大腦組織中不同時間點Mrna表達(dá)量檢測結(jié)果表明,在背肌和大腦中GPDI基因的時間序列表達(dá)譜具有相似的模式。豬GPD1基因在胚胎時間開始表達(dá),背肌中的表達(dá)在出生后第8天達(dá)到最高,而在大腦中則是第14天達(dá)到頂峰。斷奶能顯著降低該基因的表達(dá),隨后表達(dá)量又慢慢地回復(fù)到斷奶前的水平并略微有所提高,但不顯著。
(5
6、)基于Interproscan程序,對豬GPDI蛋白功能進(jìn)行初步的預(yù)測,豬GPD1基因有兩個明顯的結(jié)構(gòu)域,C末端的催化結(jié)構(gòu)域和N末端的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過基于馬爾代夫模型的swiss-model對該蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,顯示該蛋白含有8個B折疊和15個a螺旋,同時含有一個保守的底物結(jié)合基序(10-GSGNWO-15)。
(6)啟動子結(jié)構(gòu)分析表明,豬GPD1基因啟動子和人類有較高的相似性,和人類GPD1基因啟動子相比,有三段高
7、度保守的區(qū)域和一段缺失片段。就結(jié)構(gòu)而言,豬GPDI基因啟動子的5’末端有一個HindⅢ限制性酶切位點,一個遠(yuǎn)端啟動子和兩個脂肪特異性元件,并且和上游的基因有約500bp的重疊區(qū)域。
(7)啟動子活性預(yù)測分析表明,和上游重疊的區(qū)域?qū)幼拥幕钚杂幸欢ǖ拇龠M(jìn)作用。在-1187和-851之間有一個明顯的負(fù)調(diào)控元件。而在-502到-423之間有一個轉(zhuǎn)錄促進(jìn)元件,這段的缺失使啟動子活性大大降低。轉(zhuǎn)錄因子C/EBPB在豬GPD1啟動子
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