肌肉中calsarcin基因的差異表達和轉錄調控研究.pdf

1、鈣調神經(jīng)磷酸酶(CaN)屬絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，在肌肉中，calcirleurin是受Ca<'2+>信號活化的一種多功能信號酶，不僅其本身可介導多條信號轉導途徑，而且通過去磷酸化作用可對其他信號轉導途徑進行調節(jié)，將Ca<'2+>信號與其他第二信使的調節(jié)機制偶聯(lián)起來，調節(jié)肌肉中各種基因的表達，對肌肉發(fā)育有重要作用。Calsarcin家族是一個與鈣調神經(jīng)磷酸酶結合的肌肉特異蛋白質新家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的calsarcin家族成員有三個ca

2、lsarcin-1，calsarcin-2和calsarcin-3。其中，calsarcin-1 基因在心肌和骨骼肌慢肌纖維中特異表達，而calsarcin -2 和calsarcin -3 只在骨骼肌快肌纖維中特異表達。同時calsarcin還作為肌肉中Z-Disc的重要結構蛋白而存在，因此calsarcin基因可能在肌纖維的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的重要，從而對豬肉品質產(chǎn)生一定的影響。本實驗首先從豬的骨骼肌中克隆到了calsarc

3、in三個基因，對它們在染色體上的基因定位情況，肌肉發(fā)育過程中的表達規(guī)律，基因序列中的SNP位點進行了一系列分析，為進一步研究該家族基因在豬的肌肉發(fā)育中的作用奠定基礎，并為其將來運用于標記輔助育種提供依據(jù)。另外，calsarcin 家族的三個基因分別在慢肌和快肌中特異表達，本實驗還從小鼠的calsarcin基因的啟動子作為研究模型，對造成這種差異表達的基因表達調控機制做了初步的研究，考慮到與calsarcin發(fā)生互作的calcineuri

4、n在肌纖維的決定和分化中起到了關鍵作用，對calsarcin基因表達調控的研究也將為進一步闡明快慢肌纖維的決定和分化的分子機理提供依據(jù)。主要研究結果如下： 1) 從豬胚胎骨骼肌文庫中分離得到了豬calsarcin-1 基因，利用生物信息學和比較基因組學的方法克隆得到了豬的calsarcin-2和calsarcin-3基因，對三個基因的mRNA序列以及蛋白預測序列進行了初步分析。 2) 利用輻射雜種板技術分別將豬的 cal

5、sarcin-1，calsarcin-2和 calsarcin-3基因分別定位于豬的第8號，14號和2號染色體上。 3) 利用定量PCR技術檢測了calsarcin-1 和calsarcin-2 在不同組織以及不同發(fā)育時期的肌肉中的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)calsarcin-1和calsarcin-2基因的組織表達規(guī)律類似，主要在肌肉中表達。而兩個基因的在肌肉發(fā)育過程中的表達規(guī)律有顯著差異，calsarcin-1 基因在胚胎期的表達呈

6、下降趨勢，而calsarcin-2 基因的表達在同時期呈上升趨勢，兩者在出生后的表達都呈下降趨勢。 4) 構建了豬calsarcin-1和calsarcin-2基因的綠色熒光蛋白融合表達載體，轉染PK15細胞，利用共聚焦顯微鏡對這兩個蛋白在細胞內(nèi)的位置進行了定位，結果發(fā)現(xiàn)兩個融合蛋白主要都位于細胞核內(nèi)。 5) 在中外豬群中利用PCR-RFLP的方法分別對豬calsarcin-1和calsarcin-2基因的各一個SNP位

7、點進行了判型，結果發(fā)現(xiàn)中外豬種在這兩個SNP位點的基因頻率上表現(xiàn)出較大差異。 6) 利用定量PCR檢測了小鼠calsarcin-1和calsarcin-2基因在C2C12細胞分化過程中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)兩個基因在細胞分化過程中都呈上調表達。 7) 利用GenBank中的小鼠基因組信息，用長片段PCR克隆得到了小鼠 calsarcin-1和calsarcin-2基因的啟動子序列，并將其連接到pGL3-basic報告基因載

8、體中，轉染C2C12細胞發(fā)現(xiàn)報告基因的活性顯著升高，證明了這兩個啟動子的有效性。利用啟動子分析軟件TESS對小鼠calsarcin-1和calsarcin-2基因啟動子中的可能的調控元件進行了預測，然后構建了各種缺失突變的報告基因載體進行轉染，發(fā)現(xiàn)calsarcin-1啟動子中的一個可能的NFkB結合位點對該啟動子活性影響很大，而calsarcin-2啟動子中的預測的NFkB結合位點對該啟動子活性影響不大。 8) 凝膠阻滯電泳實

9、驗證實了calsarcin-1啟動子中的NFkB結合位點和NFkB轉錄因子的結合，而預測的calsarcin-2啟動子中的NFkB結合位點并沒有轉錄因子的結合。 9) 利用NFkB轉錄因子的抑制藥物PDTC對該轉錄因子進行了抑制實驗，結果發(fā)現(xiàn)PDTC能顯著抑制 calsarcin-1 啟動子的活性，而對calsarcin-2啟動子影響不大。 10) 利用NFkB，NFAT和MEF2轉錄因子的表達載體和兩個啟動子共轉染，結