褪黑素對新生兒淋巴細胞免疫功能的調(diào)節(jié).pdf

1、褪黑素 (melatonin，MLT) 是松果體合成分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素。大量研究表明，MLT具有免疫調(diào)節(jié)作用，它可誘導成人外周血單個核細胞 (peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)的細胞增殖及調(diào)節(jié)單個核細胞白細胞介素-2(interleukin-21IL-2)、白細胞介素-12(interleukin-12，IL-12)、干擾素-γ(interferon-gama，IFN-γ)及腫瘤壞死因子

2、-α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等細胞因子的釋放，但尚未見MLT調(diào)節(jié)臍血單個核細胞 (cord blood mononuclear cells，CBMC)活化增殖及細胞因子釋放的報道。由于新生兒淋巴細胞“表型"或功能與成人或較大兒童有一定的差異，因此有必要闡明MLT對發(fā)育不成熟的新生兒淋巴細胞免疫功能的作用。 目的: 探討MLT對新生兒CBMC活化增殖及細胞因子釋放的調(diào)節(jié)作用，

3、從而揭示MLT對新生兒淋巴細胞免疫功能的影響。 材料和方法: 取足月順產(chǎn)健康新生兒臍帶血10例，其中男5例，女5例；另取健康成人志愿者外周血10例，其中男5例，女5例，年齡范圍20～30歲。經(jīng)密度梯度離心法分離得到單個核細胞CBMC或PBMC懸液(調(diào)節(jié)濃度至10<'6>/ml)。分設5μg/ml PHA(phytohemagglutinin，植物血凝素)組、50ng/ml、5ng/ml、500pg/ml、50pg/ml

4、MLT組、50ng/ml IL-2組、5ng/ml MLT+5μg/ml PHA及5ng/ml MLT+50ng/ml IL-2組，各取CBMC或PBMC懸液200μl加入96孔板中與上述不同刺激物共培養(yǎng)72h，并設細胞懸液組作空白對照。運用相差顯微鏡及氚標記胸腺嘧啶核苷(<'3>H-thymidine，<'3>H-TdR)摻入法觀察MLT對CBMC形態(tài)學的影響及細胞增殖的調(diào)節(jié)，并與MLT對PBMC的作用進行比較。另取10例足月順產(chǎn)健康

5、新生兒的臍帶血及10例健康成人志愿者的外周血分離得到單個核細胞CBMC或PBMC懸液(調(diào)節(jié)濃度至10<'6>/ml)，條件同上，分設50ng/ml、5ng/ml、500pg/ml、50pg/ml MLT組及細胞懸液空白對照組，按前述同樣方法培養(yǎng)72h，運用細胞因子檢測試劑盒及Luminex100液相芯片檢測系統(tǒng)檢測培養(yǎng)上清中細胞因子白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、 IL-2、白細胞介素-4(interleu

6、kin-4，IL-4)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白細胞介素-10(intefleukin-10，IL-10)、IL-12、IFN-γ及TNF-α的含量，并與MLT對PBMC分泌相關細胞因子的作用進行比較。 結(jié)果： 1．CBMC的<'3>H-TdR摻入率隨培養(yǎng)基中MLT濃度(50pg/ml～5ng/ml)的增加而增加，在5ng/ml效果

7、最顯著，當濃度進一步增大至50ng/ml時，CBMC的<'3>H-TdR摻入率并未相應增加，反而較5ng/mlMLT組減少。 2．在加入MLT(5ng/ml)的培養(yǎng)基中，經(jīng)72h培養(yǎng)后，高倍光鏡觀察下見細胞較培養(yǎng)前明顯密集，為較多體積增大的單個核細胞。 3．CBMC培養(yǎng)基中分別加入不同刺激物MLT(5ng/ml)、IL-2(50ng/ml)、MLT+PHA(5μg/ml)、MLT+IL-2，其<'3>H-TdR摻入率(c

8、pm)分別為114327±52863、16087±9006、118360±59207和17682±7391，與細胞懸液組(14133±8688)比較，MLT組和MLT+PHA組CBMC的<'3>H-TdR摻入率顯著增加(t=5.9143，P<0.001；t=5.5078，P<0.001)，IL-2組、MLT+IL-2組CBMC的<'3>H-TdR摻入率無明顯變化(t=0.4938，P>0.05；t=0.9839，P>0.05)；而MLT

9、組或MLT+PHA組CBMC的<'3>H-TdR摻入率與培養(yǎng)基中僅加入PHA組(110397±48663)比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.1730，P>0.05；t=0.3286，P>0.05)。各種刺激物加入培養(yǎng)基后，CBMC的<'3>H-TdR摻入率均明顯高于PBMC。 4.MLT可刺激CBMC產(chǎn)生較高水平的IL-2、IL-6、IL-8、IL-12及IFN-γ，與細胞懸液組相比，差異有統(tǒng)計學意義(MLT為500pg/ml時，

10、t=-3.762，P<0.05；F3.016，P<0.05；t=3.642，P<0.05；t=3.867，P<0.05；t=5.805，P<0.05)；不同濃度MLT均可降低CBMC培養(yǎng)上清中TNF-α水平，與細胞懸液組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(MLT為50ng/ml時，t=5.441，P<0.05；MLT為5ng/ml時，t=6.957，P<0.05；MLT為500pg/ml時，t=6.633，P<0.05；MLT為50pg/ml時，

11、t=5.420，P<0.05)；但不同濃度MLT對培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-4、IL-10含量的影響，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 5.MLT也可誘導PBMC產(chǎn)生IL-2、IL-12及IFN-γ，抑制TNF-α的分泌，與對照組(PBMC細胞懸液組)比較，差異有統(tǒng)計學意義(MLT為5ng/ml時，t=3.437，P<0.05；t=2.981，P<0.05；t=3.105，P<0.05；t=4.144，P<0

12、.05)；但MLT對PBMC產(chǎn)生IL-6、IL-8的作用，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(MLT為5ng/ml時，t=1.069，P>0.05；t=0.992，P>0.05)；對IL-1β、IL-4、IL-10的作用，任一濃度與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 6.比較各自最佳效應濃度的MLT對CBMC(MLT最佳效應濃度為500pg/ml)和PBMC(MLT最佳效應濃度為5ng/ml)釋放細胞因子IL-2、IL

13、-12、IFN-γ的誘導作用及對TNF-α的抑制作用，除IL-2(t=-1.9330，P>0.05)外，差異均有統(tǒng)計學意義(IL-12：t=3.250，P<0.05；IFN-γ：t=2.546，P<0.05：TNF-α：t=3.097，P<0.05)，且MLT對CBMC分泌細胞因子的調(diào)節(jié)作用顯著強于其對PBMC的作用。 結(jié)論： MLT不但可誘導PBMC活化增殖及調(diào)節(jié)其細胞因子的釋放，也可誘導CBMC的活化增殖及調(diào)節(jié)其細胞