17-β雌二醇調(diào)控綿羊輸卵管上皮細(xì)胞β-防御素1基因表達(dá)過程中NF-κB信號通路的研究.pdf

1、動物在自然界生存中會受到各種病菌侵染的威脅，因此動物在長期進化的過程中形成的先天性免疫系統(tǒng)可有效的對抗病原菌的侵染。防御素是一類富含半胱氨酸并廣泛分布于各種動物組織和細(xì)胞的內(nèi)源性陽離子抗菌肽(AMPs)，是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。由于防御素具有廣譜的細(xì)菌和病毒抗性，可有效對抗病原菌的侵染，但其所具有的細(xì)胞毒性會對細(xì)胞生長不利，因此對防御素表達(dá)調(diào)控的研究有著重要的意義。
　　之前的研究表明在綿羊發(fā)情期間，其血液雌激素變化同綿羊

2、生殖器官內(nèi)SBD1表達(dá)呈正相關(guān)，說明雌激素可能參與綿羊生殖器官內(nèi)SBD1的表達(dá)調(diào)控。進一步研究表明SBD1 mRNA在綿羊輸卵管黏膜層上皮細(xì)胞游離面的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，而固有層、肌層、結(jié)締組織中無表達(dá)，因此可進行體外雌激素對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)SBD1表達(dá)調(diào)控機制的研究，以闡明雌激素對綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD1表達(dá)的調(diào)控機制。通過RT-qPCR方法檢測不同劑量17-β雌二醇在不同時間段對SBD1表達(dá)的影響，證實了SBD1表達(dá)量在細(xì)胞添加10

3、-8M E2后6h左右達(dá)到最高。通過RT-qPCR方法檢測細(xì)胞添加10-8M E2后0至10.5 h后細(xì)胞內(nèi)SBD1表達(dá)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加E2后SBD1表達(dá)量在1.5至10.5h呈現(xiàn)顯著性升高(P＜0.05)，在3.5h為其最高表達(dá)量時間點。通過RT-qPCR方法檢測了預(yù)孵育GPR30激動劑、ERs抑制劑或PKA、PKC和NF-κ B信號通路關(guān)鍵蛋白抑制劑后再添加E2的細(xì)胞內(nèi)SBD1在不同時間段的表達(dá)量變化，進一步證明了17-β雌二醇

4、誘導(dǎo)SBD1的表達(dá)在前期需要通過GPR30所介導(dǎo)非基因組途徑，且需要PKA、PKC和NF-κB三條信號通路的共同參與，而在后期需要雌激素受體所介導(dǎo)的基因組途徑。
　　實驗通過蛋白質(zhì)印跡方法、RT-qPCR方法檢測了細(xì)胞添加E2后NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白和NF-κB基因在不同時間段表達(dá)量變化，并通過ChIP方法檢測NF-κB蛋白結(jié)合SBD1啟動子比率的變化，闡明了NF-κB信號通路在17-β雌二醇誘導(dǎo)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞SBD1基因

5、表達(dá)中的作用機制:靜息狀態(tài)下的NF-κB同抑制蛋白家族的Iκ B相結(jié)合形成無活性復(fù)合體游存于細(xì)胞胞漿內(nèi)，加入的E2作為外界刺激因子同GPR30結(jié)合并產(chǎn)生一系列的級聯(lián)反應(yīng);0.5h后IκB蛋白發(fā)生磷酸化生成p-IκB蛋白，隨后p-IκB蛋白通過泛素化被降解，游離的NF-κB蛋白被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)，1h后轉(zhuǎn)運入核的NF-κB蛋白同SBD1啟動子結(jié)合并激活SBD1的轉(zhuǎn)錄;隨著細(xì)胞質(zhì)內(nèi)I-κB蛋白的降低，細(xì)胞不斷新生成I-κB并在外源17-β雌二

6、醇繼續(xù)刺激下發(fā)生磷酸化，但由于高表達(dá)SBD1的細(xì)胞毒性，細(xì)胞通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)終止NF-κB信號通路，進而通過細(xì)胞內(nèi)部磷酸化、脫磷酸化和泛素化使細(xì)胞內(nèi)蛋白回歸穩(wěn)態(tài)。
　　以上實驗結(jié)果表明，17-β雌二醇誘導(dǎo)輸卵管上皮細(xì)胞中SBD1的表達(dá)在前期需要通過GPR30所介導(dǎo)非基因組途徑，且需要PKA、PKC和NF-κB信號通路三條信號通路的共同參與，而在后期需要雌激素受體所介導(dǎo)的基因組途徑。細(xì)胞通過蛋白磷酸化、泛素化、p65蛋白核轉(zhuǎn)運和負(fù)反饋