苯并芘誘導人支氣管上皮細胞轉(zhuǎn)化過程中Sirt1調(diào)控TNF-α表達的機制研究.pdf

1、目的:研究去乙?；窼irt1對B[a]P誘導的支氣管上皮細胞炎性反應(yīng)中TNF-α表達的調(diào)控作用和調(diào)控機制，以及對細胞遷移和侵襲的影響。
　　背景:沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator1，Sirt1)是一個具有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+依賴性的Ⅲ類組蛋白去乙?；?，它可以使組蛋白和非組蛋白因子發(fā)生去乙?；瑥亩{(diào)控細胞衰老、細胞凋亡、能量代謝、DNA修復以及細胞凋亡等生命過程。人類Sir

2、t1通過調(diào)控細胞的存活以及能量代謝過程中等多種機體的生理以及病理性過程，從而參與了多種人類疾病如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤壞死因子TNF-α是一種主要由單核巨噬細胞、淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子，它具有多種生物學功能，在細胞凋亡、生存、炎癥反應(yīng)和免疫防御等方面都發(fā)揮了重要的作用，是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)。由于炎癥環(huán)境能夠促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此炎癥的持續(xù)存在與癌癥的形成之間存在緊密聯(lián)系。同時，

3、Sirt1可以和多種細胞因子相互作用對機體產(chǎn)生不同的影響，其中就包括有腫瘤壞死因子TNF-α，在炎癥過程和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究是在苯并芘B[a]P暴露下，Sirt1基因?qū)δ[瘤壞死因子TNF-α的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)節(jié)機制的初步探索。
　　方法:
　　1.Western Blot蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測Sirt1蛋白的表達水平
　　提取Beas-2B細胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，然后采用Western

4、Blot檢測Sirt1蛋白表達情況。
　　2.Real-time PCR鑒定Sirt1 mRNA的表達
　　提取Beas-2B細胞的總RNA，NANO DROP2000測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄后通過Real-time PCR檢測Sirt1 mRNA的表達情況。
　　3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　將Sirt1基因過表達質(zhì)粒、Sirt1基因沉默質(zhì)粒和相對應(yīng)的空載體采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到人支氣管上皮細胞（Beas-2B）中，采用We

5、stern Blot蛋白質(zhì)印跡技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)染效果，加抗生素篩選出Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression、Beas-2B-pGPU6、Beas-2B-Sirt1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。
　　4.Real-time PCR檢測炎癥因子TNF-α mRNA的表達
　　提取Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression、 Beas-2B

6、-pGPU6、Beas-2B-Sirt1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的總RNA，NANO DROP2000測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄后通過Real-time PCR檢測TNF-α mRNA的表達情況。
　　5.構(gòu)建質(zhì)粒
　　根據(jù)UCSC Genome Browser網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫檢索獲得的TNF-α啟動子序列設(shè)計引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增目的片段，然后將目的片段和載體進行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細胞，

7、提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒雙酶切鑒定，同時送公司進行DNA測序。
　　6.雙熒光素酶活性檢測
　　將構(gòu)建成功的TNF-α啟動子雙熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測Sirt1對TNF-α轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。
　　7.Transwell細胞遷移實驗檢測細胞的遷移能力。
　　8.Trans

8、well細胞侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:在Beas-2B細胞中，經(jīng)8uM苯并芘B[a]P刺激后Sirt1的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平均升高。和Beas-2B-pcDNA3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞相比，在Beas-2B-Sirt1-overexpression穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中，經(jīng)8uM苯并芘B[a]P刺激細胞后TNF-α mRNA表達升高，而且細胞遷移能力和侵襲能力也增加。和Beas-2B-pGPU6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞相比，在Beas-2

9、B-Sirt1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中，經(jīng)8uM苯并芘B[a]P刺激后TNF-α mRNA表達水平的升高程度降低，同時細胞遷移能力和侵襲能力也相應(yīng)減弱。成功構(gòu)建的TNF-α啟動子雙熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Beas-2B-pcDNA3.1和Beas-2B-Sirt1-overexpression穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞發(fā)現(xiàn)，TNF-α啟動子雙熒光素酶活性的變化和TNF-α mRNA水平變化一致，可以得出Sirt1通過調(diào)控TNF-α的轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)