苯并芘誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中Sirt1調(diào)控TNF-α表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究去乙?；窼irt1對(duì)B[a]P誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)中TNF-α表達(dá)的調(diào)控作用和調(diào)控機(jī)制，以及對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
　　背景:沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator1，Sirt1)是一個(gè)具有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+依賴性的Ⅲ類組蛋白去乙?；?，它可以使組蛋白和非組蛋白因子發(fā)生去乙?；瑥亩{(diào)控細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、能量代謝、DNA修復(fù)以及細(xì)胞凋亡等生命過(guò)程。人類Sir

2、t1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的存活以及能量代謝過(guò)程中等多種機(jī)體的生理以及病理性過(guò)程，從而參與了多種人類疾病如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤壞死因子TNF-α是一種主要由單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，它具有多種生物學(xué)功能，在細(xì)胞凋亡、生存、炎癥反應(yīng)和免疫防御等方面都發(fā)揮了重要的作用，是炎癥反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)。由于炎癥環(huán)境能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此炎癥的持續(xù)存在與癌癥的形成之間存在緊密聯(lián)系。同時(shí)，

3、Sirt1可以和多種細(xì)胞因子相互作用對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同的影響，其中就包括有腫瘤壞死因子TNF-α，在炎癥過(guò)程和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。本研究是在苯并芘B[a]P暴露下，Sirt1基因?qū)δ[瘤壞死因子TNF-α的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制的初步探索。
　　方法:
　　1.Western Blot蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)Sirt1蛋白的表達(dá)水平
　　提取Beas-2B細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后采用Western

4、Blot檢測(cè)Sirt1蛋白表達(dá)情況。
　　2.Real-time PCR鑒定Sirt1 mRNA的表達(dá)
　　提取Beas-2B細(xì)胞的總RNA，NANO DROP2000測(cè)定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄后通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)Sirt1 mRNA的表達(dá)情況。
　　3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　將Sirt1基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、Sirt1基因沉默質(zhì)粒和相對(duì)應(yīng)的空載體采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到人支氣管上皮細(xì)胞（Beas-2B）中，采用We

5、stern Blot蛋白質(zhì)印跡技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)染效果，加抗生素篩選出Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression、Beas-2B-pGPU6、Beas-2B-Sirt1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　4.Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子TNF-α mRNA的表達(dá)
　　提取Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression、 Beas-2B

6、-pGPU6、Beas-2B-Sirt1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的總RNA，NANO DROP2000測(cè)定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄后通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)TNF-α mRNA的表達(dá)情況。
　　5.構(gòu)建質(zhì)粒
　　根據(jù)UCSC Genome Browser網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得的TNF-α啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段，然后將目的片段和載體進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，

7、提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒雙酶切鑒定，同時(shí)送公司進(jìn)行DNA測(cè)序。
　　6.雙熒光素酶活性檢測(cè)
　　將構(gòu)建成功的TNF-α啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)Sirt1對(duì)TNF-α轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。
　　7.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。
　　8.Trans

8、well細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:在Beas-2B細(xì)胞中，經(jīng)8uM苯并芘B[a]P刺激后Sirt1的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平均升高。和Beas-2B-pcDNA3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，在Beas-2B-Sirt1-overexpression穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，經(jīng)8uM苯并芘B[a]P刺激細(xì)胞后TNF-α mRNA表達(dá)升高，而且細(xì)胞遷移能力和侵襲能力也增加。和Beas-2B-pGPU6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，在Beas-2

9、B-Sirt1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，經(jīng)8uM苯并芘B[a]P刺激后TNF-α mRNA表達(dá)水平的升高程度降低，同時(shí)細(xì)胞遷移能力和侵襲能力也相應(yīng)減弱。成功構(gòu)建的TNF-α啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Beas-2B-pcDNA3.1和Beas-2B-Sirt1-overexpression穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，TNF-α啟動(dòng)子雙熒光素酶活性的變化和TNF-α mRNA水平變化一致，可以得出Sirt1通過(guò)調(diào)控TNF-α的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)調(diào)